DAP-seq与RNA-seq联合分析助力揭示AvERF73通过参与低氧应答和甲羟戊酸途径正调控猕猴桃的耐涝性

涝害（Waterlogging）是长期阴雨或暴雨后，由于地表积水，地面径流不能及时排除，积水深度过大，时间过长，造成作物根部氧气不足，并产生乙醇等有毒有害物质，从而影响作物生长，甚至造成作物死亡，造成农业减产的灾害。

猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）也称奇异果，原产于中国。猕猴桃因其独特的风味，富含维生素C，被誉为水果之王。目前已经跻身于世界主流消费水果之列。猕猴桃可以预防老年骨质疏松，抑制胆固醇的沉积，防治动脉硬化，改善心肌功能，防治心脏病，也能对抗癌起作用。

2024年2月2日，中国农业科学院郑州果树研究所果树生长发育与质量控制重点实验室的研究成果，发表在Horticultural Plant Journal期刊上（IF=5.7），文章题目为“AvERF73 positively regulates waterlogging tolerance in kiwifruit by participating in hypoxia response and mevalonate pathway” 。该研究使用DNA亲和测序（DAP-seq）技术和转录组测序（RNA-seq）技术揭示了AvERF73通过参与低氧应答和甲羟戊酸途径，正调控猕猴桃的耐涝性。

1.对AvERF73进行序列分析

作者在A. valvata KR5中鉴定出一个受洪涝诱导的ERF-VII基因，命名为AvERF73。随后，作者检测了AvERF73在不同组织中的表达情况，发现其在根系中的含量最高。系统发育树分析显示，AvERF73与AcERF74的蛋白序列最接近。蛋白序列分析显示，AvERF73含有一个AP2保守结构域，这个结构域含有Ala14和Asp19保守位点，说明AvERF73属于ERF转录家族。之后作者将AvERF73与GFP融合表达，并在细胞核中检测到GFP荧光，证明AvERF73定位于细胞核中。

2.在拟南芥中过表达AvERF73提高了拟南芥的耐涝害能力

为研究AvERF73基因的功能，作者在拟南芥中过表达AvERF73基因，进行涝胁迫，发现过表达植株比WT植株更耐涝害，证实了AvERF73的过表达增强了拟南芥的耐涝害能力。

3.过表达AvERF73增强了猕猴桃的耐涝害能力

为进一步证实AvERF73在猕猴桃中的作用，作者利用“红阳”猕猴桃叶条外植体转化获得了两个过表达的猕猴桃品系OE53和OE65。涝胁迫后， 与过表达品系相比，WT植株出现了明显的叶片枯萎症状，叶绿素水平降低，根部H2O2和MDA含量升高，而过表达品系生长良好。表明AvERF73在应对涝胁迫方面发挥着有益的作用。

4.转录组分析鉴定AvERF73调控的基因

为了更好地探究AvERF73在涝胁迫下的分子机制，作者对OE53和WT植株进行转录组测序（RNA-seq）。qRT-PCR检测和相关性分析均表明转录组数据准确可靠。结果分析发现，在涝胁迫下，与WT植株相比，OE53植株的上调基因在“cellular response to hypoxia”途径显著富集，这些低氧应答基因（HRGs )包含很多转录因子，例如LOB，WRKY，锌指蛋白和NAC。，此外，上调基因在萜类化合物和甾醇生物合成过程也显著富集，并且编码MVA途径关键酶的基因表达上调。由此推测AvERF73可能调控HRGs的表达，同时激活MVA通路积累萜类化合物和甾醇来应对涝胁迫。

5.全基因组范围内鉴定AvERF73的靶基因

为了鉴定AvERF73调控的靶基因，作者以OE53和WT植物的根部为材料进行了DAP-seq。两次重复共鉴定到3744个基因，同时鉴定到AvERF73结合的GCC-box (‘GCCGCC’) motif。随后作者将DAP-seq与RNA-seq数据联合分析，找到了16个上调的AvERF73 可能直接靶向基因（DTGs）并进行重点关注。

6.AvERF73直接参与缺氧应答和MVA通路提高猕猴桃的耐涝渍能力 

为了进一步揭示AvERF73的潜在DTG。Venn图分析发现，在"cellular response to hypoxia"和MVA途径中，AcNAC022和AcHMGS1基因为AvERF73的潜在DTGs。Dual-Luc实验发现AcNAC022和AcHMGS1与AvERF73蛋白呈正相关关系。据此推测，AvERF73调控了AcNAC022和AcHMGS1的表达。

小结

结果表明，AvERF73是猕猴桃耐涝性的重要调节因子。一方面，过表达AvERF73可以激活AcNAC022的表达，以应对涝胁迫引起的缺氧。另一方面，过表达AvERF73可能通过直接激活AcHMGS1表达来调节合成萜类化合物和甾醇的MVA途径。然而，AvERF73与AcNAC022和AcHMGS1的相互作用调控猕猴桃耐涝能力的机制有待进一步探索。本研究结果为研究猕猴桃耐涝调控网络提供了候选基因和新思路。