染色质免疫沉淀(ChIP)技术笔记之(5)：所用ChIP kit 及仪器

第五部分：Smart-ChIP™ ChIP Kit

组分清单（共计19个组分）

编号	组分名称	数量	保存	注意事项
下列组分收到后需储存在 4 °C中，磁珠千万不要冷冻。
IF0002	ChIP级Protein A/G 磁珠 (单链鲑鱼精DNA预包被)	1 mL*2	+4 °C	不能冷冻
ChIP-001	10×交联终止剂	48 mL	+4 °C
ChIP-002	Chromatin Extract Buffer	24 mL	+4 °C
ChIP-005	ChIP Wash Buffer 1	24 mL	+4 °C
ChIP-006	ChIP Wash Buffer 2	24 mL	+4 °C
ChIP-007	ChIP Wash Buffer 3	24 mL	+4 °C
ChIP-008	ChIP Wash Buffer 4	24 mL	+4 °C
ChIP-009	ChIP Elution Buffer	7.2 mL	+4 °C	如有絮状物，使用前需要置室温恢复溶解
ChIP-011	TCEP	572 mg	+4 °C	使用前配制，工作终浓度为50 mM
下列组分收到后必须要储存在 -20 °C中
ChIP-017	MNase 微球菌核酸酶	30 µL	-20 °C
ChIP-003	1×Cleavage Buffer	3 mL	-20 °C
ChIP-004	0.5M酶切终止剂	1.5 mL	-20 °C
ChIP-018	RNase A (10 mg/mL)	100 µL	-20 °C	使用时需要加入钠盐
ChIP-019	Proteinase K (20 mg/mL)	100 µL	-20 °C
ChIP-012	DNA沉淀增强物	100 µL	-20 °C
ChIP-010	ChIP专用盐溶液	1.5 mL	-20 °C
ChIP-020	2×热启动荧光定量PCR Master Mix套装（含有ROX I,ROX II各100µL）	1.25 mL*2	-20 °C
ChIP-021	ChIP级Normal Mouse IgG 阴性对照	200 µL	-20 °C
ChIP-022	ChIP级Normal Rabbit IgG 阴性对照	200 µL	-20 °C

备注：本实验笔记所采用的ChIP Kit信息如下：

Engibody, Cat no: ChIP-1001, 名称: Smart-ChIP™ ChIP Kit

通用试剂

• 目的蛋白抗体（ChIP级抗体）

注意：如果不是使用未偶联任何基团的单纯抗体，而是使用商品化的抗体偶联beads（最常用的是ChIP级的GFP抗体偶联磁珠），那么在ChIP实验中则不需要做标准Protocol中的Protein A/G 磁珠捕获抗体-染色质复合物这一步了。因为GFP 抗体偶联磁珠已经一步到位，直接捕获了目的染色质片段（GFP抗体磁珠通过识别、结合染色质上的GFP融合转录因子而捕获目的染色质），然后就可以进入标准Protocol中的Wash洗涤环节了。

• 37% 甲醛Formaldehyde (必须是保质期内的，新鲜的)

• 无核酸酶的灭菌水DNase and RNase-free sterile H2O (例如Millipore Nuclease-free water, Cat# 3098)

• 1× PBS, 1× TBS, 缓冲液使用前必须预冷

• 2%琼脂糖凝胶及无水乙醇

•苯酚-氯仿-异戊醇混合物（V/V，25:24:1），sigma，货号：516726

• Smart-Lib™ DNA建库试剂盒 for illumina® （超声及MNase法），品牌：Engibody，货号为LIB-SEQ-30000-12。用于ChIP-seq中对免疫富集得到的DNA片段进行测序文库构建时需要。

• 全长接头试剂盒Multiplex Oligos for Illumina® (Full Length Adaptors) (for ChIP-seq, CUT&RUN)，品牌：Engibody，货号为LIB-SEQ-30001，用于ChIP-seq中对免疫富集得到的DNA片段进行测序文库构建时需要。

• 蛋白酶抑制剂Protease Inhibitor Cocktail及磷酸酶抑制剂Phosphatase Inhibitor Cocktail

注意：

1、必须使用不含EDTA的蛋白酶抑制剂，例如Roche的cOmplete™蛋白酶抑制剂混合物，就是不含EDTA的，货号11873580001， 含有20个tablets，水溶剂型。将一片cOmplete蛋白酶抑制剂片剂溶于2ml无核酸酶水，现配25×的stock buffer。

2、因为极易失效，一定要现用现配。

3、磷酸酶抑制剂对保留转录因子等蛋白的磷酸化修饰极其重要。

仪器与耗材

• 细胞刮Cell scraper

• 研钵

• 杜恩斯玻璃匀浆器（品牌：sigma，货号：D9063，品名：KIMBLE Dounce组织匀浆套装，规格：7mL）

• 细胞筛网Cell Strainer (fisher细胞筛网, 膜孔径70 µm)

• 水平摇床Orbital shaker

• 1.5ml孔的磁力架 (品名：24-Tube Magnetic Separation Rack，品牌：Engibody, 货号: IF9050，规格：24*1.5mL / 2mL)

• Vortex mixer

• 旋转混匀仪

• 微量高速冷冻离心机

• 低速离心机（用于细胞收集）

• 超声仪Sonicator （仅在甲醛固定交联样本的ChIP实验中需要）

• 恒温金属浴Thermomixer

• 恒温水浴锅

• DNA水平电泳仪（用于DNA片段大小的质控）

• 凝胶成像仪（用于DNA片段大小的质控）

• Nanodrop 微量分光光度计（用于DNA片段浓度的测定）

• 常规PCR仪Thermal cycler（仅在ChIP下游的PCR实验中需要）

• 荧光定量PCR仪Thermal cycler（仅在ChIP下游的荧光定量PCR实验中需要）

• DNA NGS测序仪（Illumina测序仪）（仅在ChIP下游的sequence测序中需要）

实验防护:

• 请在实验中穿好实验服，带上口罩和手套，避免吸入试剂。

•蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂有毒, 避免吸入及皮肤接触。

•操作甲醛应该置于通风橱中，避免吸入和皮肤接触。