Mothur4进阶_Mothur扩增子基因序列处理_物种注释及发育分析

本节主要介绍了使用Mothur软件对扩增子基因序列进行物种注释及系统发育树构建。

01OTUs

现在有两个选项可以将序列聚类到OTU中。本数据为小型数据集，可以使用dist.seqs和cluster执行传统方法。

屏幕输出：

输出文件：stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.dist

文件注释：前两列为序列名称，第三列是两个序列之间距离计算结果。

屏幕输出：

输出文件：

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.opti_mcc.list

文件注释：该文件为524个OTU每个所包含的序列。

输出文件：stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.opti_mcc.steps

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.opti_mcc.sensspec

另一种选择是使用cluster.split命令。在这种方法中，使用分类学信息将序列分为多个bin，然后在每个bin中进行聚类。优点是它更快，占用内存更少，并且可以在多个处理器上运行。在此命令中使用taxlevel=4，对应于Order的级别。

命令注释：cluster.split命令用于将序列对齐至otus并输出.list文件。

屏幕输出：

输出文件：

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.dist

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.opti_mcc.list

文件注释：每一个otu中包含的序列名称。

输出文件：stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.opti_mcc.sensspec

使用make.shared命令可以知道每个组中每个OTU中有多少序列。在这里将Mothur的阈值设置为0.03，

屏幕输出：

输出文件：stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.opti_mcc.shared

文件注释：该文件包含每组样品的OTU数量，可以根据比例绘制OTU丰度柱状图。

命令注释：classify.out命令用于otu的物种注释。

屏幕输出：

输出文件：

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.opti_mcc.0.03.cons.taxonomy

文件注释：举例说明—在样本中观察到Otu008一共5337次，并且所有序列（100％）都被归类为Alistipes（另枝菌属）的成员。

输出文件：stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.opti_mcc.0.03.cons.tax.summary

02ASVs

OTU通常表示彼此之间相差不超过3％的序列。相反，如果序列彼此不同，ASVs（又称ESVs）会努力将它们区分为不同的OTU。ASV通常是一组相互间隔一个或两个碱基的序列。Mothur中内置的用于识别ASV的方法是pre.cluster。将序列聚类为ASV，然后删除嵌合体和污染物序列。可以使用make.shared命令将用于形成OTU的fasta和count_table文件转换为共享文件。

屏幕输出：

输出文件：

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.denovo.vsearch.pick.pick.pick.asv.shared

文件注释：从该文件可以知道依据ASV分类每组分别有2426个OTUs以及每组包含的单个OTU的数量。

输出文件：stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.denovo.vsearch.pick.pick.pick.asv.list

文件注释：单个OTU所包含的序列。

这会产生一个共享和列表文件。可以使用的共享文件就像形成OTU或phylotypes的共享文件一样。可以使用列表文件为每个ASV生成共同的物种（consensus taxonomy）。

屏幕输出：

输出文件：

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.denovo.vsearch.pick.pick.pick.asv.asv.cons.taxonomy

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.denovo.vsearch.pick.pick.pick.asv.asv.cons.tax.summary

名词解释

物种分类（Taxonomy of species）：通过将ASV/OTU等特征序列，与具有已知分类组成的序列参考数据库进行比较来实现物种注释。具体来说就是为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用统计学算法对一定相似度水平的OTU代表序列进行比对分析，并分别在各个分类水平domain（域），kingdom（界），phylum（门），class（纲），order（目），family（科），genus（属），species（种）统计各样品的群落组成。

相对丰度：即序列数除以该样品的测序总序列数。

ASVs（Amplicon sequence variants）：扩增序列变体。

03Phylotypes

对于某些分析，希望根据它们的分类学分类将序列分类到phylotypes。可以使用phylotype命令，

命令注释：Phylotype命令用于将基于物种分类将序列对齐至otus并输出.list、.rabund、.sabund文件。

屏幕输出：

输出结果注释：与cluster/cluster.split相比，phylotype的临界值编号略有不同。屏幕上列出的1到6是级别分别对应从属到界的水平。

输出文件：

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pds.wang.pick.pick.tx.sabund

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pds.wang.pick.pick.tx.rabund

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pds.wang.pick.pick.tx.list

如果需要genus级别的共享文件，可以执行以下操作，屏幕输出：

输出结果注释：屏幕上列出的1是具体分类级别。

输出文件：stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pds.wang.pick.pick.tx.shared

文件注释：第一列是lable,第二列是组名，第三列是numOtus，后面每列为不同OTU数量。

在phylotypes上运行classify.out弄清楚这些OTU的物种注释，

屏幕输出：

输出文件（举一个例子）：stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pds.wang.pick.pick.tx.1.cons.tax.summary

文件注释：各分类级别的每组不同物种的情况。

04Phylogenetic

使用依赖于系统发生树的方法（例如计算系统多样性或unifrac命令）需要生成树。随着序列数量的增加，此过程变得不稳定。以下是如何使用dist.seqs和Clearcut。

屏幕输出：

输出文件：stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.phylip.dist

命令注释：clearcut命令可使用户在mothur内部运行clearcut程序。

屏幕输出：

输出文件：系统发育树文件

stability.trim.contigs.good.unique.good.filter.unique.precluster.pick.pick.pick.phylip.tre

文件注释：可以使用其他软件进行绘制，例如MEGA。

名词解释

Phylotype：系统型，基于其分类分配序列到OTU并输出.list，.rabund和.sabund文件。

系统发生树（Phylogenetic tree）：又称为演化树（evolutionary tree），具有共同祖先的各物种间演化关系的树，是一种亲缘分支分类方法（cladogram）。在树中，每个节点代表其各分支的最近共同祖先，而节点间的线段长度对应演化距离（如估计的演化时间）。

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提取码：1234

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转载自原创文章：

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