最详细的质粒构建/引物设计教程分享

质粒构建和引物设计是分子生物学中常见的实验操作，以下是详细的步骤和注意事项：

1. 质粒构建的基本流程**

（1）目标序列的获取  

从基因库获取：如NCBI、ENSEMBL等。

人工设计：根据实验需求设计编码序列（如添加标签序列、突变位点等）。

（2）载体的选择  

表达载体：常用于蛋白表达，如pET、pcDNA系列。

克隆载体：用于扩增，如pUC19。

选择时需考虑：

启动子类型（如CMV、T7）。

抗性标记（如Amp、Kan）。

多克隆位点（MCS）。

（3）构建策略  

   酶切连接：通过限制性内切酶切割目标序列和载体，随后连接。

   -Gibson Assembly：多片段定向连接，适合无酶切位点或复杂构建。

   -重组克隆：如使用Gateway、In-Fusion克隆试剂盒。

   - PCR克隆：直接扩增目的片段并插入载体。

2. 引物设计的步骤**

引物设计是质粒构建中的关键环节，以下是详细步骤：

（1）基本要求  

   长度*：18-25 bp。

   GC含量：40%-60%，避免过高或过低。

   Tm值：55°C-65°C（上下游引物的Tm值差异小于2°C）。

   特异性：避免形成二级结构（如发夹结构、自互补）。

引物末端：3'末端尽量以G或C结尾，提高扩增效率。

（2）添加特殊序列  

   酶切位点：引物5'端添加合适的酶切位点，同时加上3-6 bp的保护碱基。

   标签序列：如FLAG、His-tag，或突变设计。

（3）工具和软件  

在线工具：

  - [Primer3](https://primer3.ut.ee/)：经典引物设计工具。

  - [SnapGene](https://www.snapgene.com/)：便捷的克隆设计工具。

  - [Benchling](https://www.benchling.com/)：多功能分子生物学工具。

   -分析软件：用OligoAnalyzer分析潜在的二级结构和自互补性。

以Nrf2为列对引物设计及质粒构建步骤进行阐述：

1. 打开NCBI官网：National Center for Biotechnology Information

2. 打开TaKaRa引物设计网址：Primer design and other tools

把整个质粒复制到里面。

选上1，然后在2部分搜酶切位点，选中3，把第一步的目的基因粘贴到4（我一般会在目的基因前面加个GCCACC（Kozak 序列），这样可以增加蛋白产量，如果目的基因后面连接了tag，就把最后三个终止密码子删掉，没有的话就不需要），然后点5。

下载下来，解压，分别为构建好的质粒跟引物。

打开输入特征中的第一个

打开骨架质粒

添加特征

选中你的目的基因，特征-添加特征-命名Nrf2

点引物-添加引物，复制表中的引物，分别添加F和R引物。

添加完后点最底下的引物，后点最上面的行动，选聚合酶链反应（PCR）

把F和R分别选到引物1和2，然后点右下角聚合酶链反应（PCR），会生成一个新的DNA文件，这个就是模拟PCR后的产物，保存。

点红框，然后点比对，把刚刚保存的PCR产物选上，就会出现下图结果。

滑动比较看是否有错误，没有错误（好像是红色小框）就可以订引物进行质粒构建了。最后可以自己改一下名字。

以上就是在质粒构建中，引物设计及质粒重构的操作教程，最后非常感谢北京大学吴博士（WSH）分享的质粒重构教程，祝吴博士科研顺利，CNS文章发发发！！！

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