标志物研究怎么做？丨一文了解两大主流蛋白质组学生物标志物研究思路！

在当今生命科学的浩瀚海洋中，蛋白质组学作为探索生物体内蛋白质组成、功能及相互作用的强大工具，正引领着生物标志物研究的热潮。生物标志物是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变，甚至是潜在变化的生化指标，其发现和应用不仅推动了医学诊断技术的进步，也为精准医疗的发展奠定了坚实基础。今天就让我们追逐这波热潮，一起来学习两种主流的蛋白质组学生物标志物研究思路吧！

20世纪末，随着质谱技术的突破迭代，蛋白质组学研究进入了崭新的阶段。目前生物标志物作为疾病诊断、预后评估及治疗效果监测的关键指标，已经成为了蛋白质组学研究的热门方向，其重要性不言而喻。以“proteomics“和”biomarker“作为关键词在NCBI上进行检索，可以发现每年的发文数稳步上升，生物标志物研究作为热门研究领域正在飞速发展。

图1 蛋白质组学生物标志物发文趋势

据不完全统计，目前已有数千种潜在生物标志物被鉴定出来，并在多种疾病的早期诊断、病情监测及疗效评估中展现出巨大潜力。例如，在肿瘤学领域，基于蛋白质组学的生物标志物研究已经实现帮助医生更准确地判断肿瘤类型、分期及预后，为制定个性化治疗方案提供了科学依据。

那么应该如何开展生物标志物研究呢？接下来小谱为您详细介绍生物标志物研究的两大研究策略——【三角策略】与【矩形策略】。

三角策略是一种经典的生物标志物研究路径，其核心思想是从小规模研究中发现潜在生物标志物，随后在大规模队列中进行验证。这一策略的实施通常分为以下几个步骤：

1.发现阶段：利用高通量、高灵敏度的质谱检测技术对小规模样本（通常十几到几十个样本）进行筛查，初步筛选出的差异表达蛋白可能有十几到几十个，将作为候选生物标志物。

2.验证阶段：在更大规模的样本队列中（通常几十到几百个样本），用PRM靶向定量分析验证差异蛋白，对初筛得到的候选生物标志物进行进一步验证，以确认其稳定性和可靠性。经过验证筛查出的蛋白生物标志物数量通常被控制到几个到十几个。

3.确认阶段：这一阶段再次扩大样本（上百上千乃至上万个样本），用酶联免疫（ELISA）或免疫组化（IHC）等技术最终验证差异蛋白是否为生物标志物。最终将经过严格验证的生物标志物应用于临床实践，建立基于该蛋白的诊断、预后或疗效评估模型。

图2 三角策略示意图

目前三角策略是基于蛋白质组学开展生物标志物研究最常用的研究策略，在三个阶段，分别涉及三种不同的技术。然而在现实研究中通常难以完整地实现全部流程，因此很多研究论文并不严格要求走到最后确认阶段，仅通过发现队列筛选生物标志物，再通过验证队列进行检验即可。且在第二步验证阶段的检测技术也不局限为PRM，可采用IHC、ELISA或其他质谱技术来进行验证。

以具体文献为例，在“Early plasma proteomic biomarkers and prediction model of acute respiratory distress syndrome after cardiopulmonary bypass: a prospective nested cohort study”这篇研究中寻找了血浆中与体外循环-术后急性呼吸窘迫综合征（CPB-ARDS）发生有关的蛋白生物标志物。研究者首先构建了一个40例（20v20）的CPB-ARDS的发现队列，通过质谱检测技术确定了4个候选生物标志物。接着进一步构建了一个150例（50v100）的CPB-ARDS和非ARDS的验证队列，对候选生物标志物进行ELISA验证，最终确定了3个蛋白为该疾病的生物标志物。文章应用了生物标志物发现的“三角策略”，谱度众合是本文的共同作者单位。

图3 文献三角策略示意图

得益于质谱技术的迅猛发展，检测成本大大降低，越来越多的研究采用了矩形策略。与三角策略不同，矩形策略强调在两个平行的大规模队列中同时进行生物标志物的发现和验证。简单来说，矩形策略的特点就是【平行筛选，交叉验证】。

1.同时建立两个平行独立大规模样本队列（通常几十到几百个样本），通过相同的质谱检测技术进行样本检测，并开展蛋白质组学分析，各自筛选出两个队列的差异蛋白作为候选生物标志物，即【平行筛选】。

2. 进一步在两个平行队列之间对候选生物标志物进行【交叉验证】，即对两个独立队列中的候选生物标志物取交集，两个队列同时作为发现队列及对方的验证队列，避免了验证队列对于发现队列的依赖，以确认生物标志物稳定性和可靠性。

图4 矩形策略示意图

矩形策略的实施依赖于高通量、高准确度的质谱检测技术以及强大的数据分析能力。这种研究路径通过【平行筛选、交叉验证】提高了验证效率。

以具体文献为例，在“Urinary proteome profiling for stratifying patients with familial Parkinson's disease”这篇研究中寻找了尿液中与帕金森病（PD）发生有关的蛋白生物标志物。

研究者构建了两个平行独立的帕金森病（PD）研究队列，其中队列1共包含120例尿液样本（52健康vs68帕金森），队列2共包含115例尿液样本（63健康vs52帕金森）。两个队列同样采用基于质谱的蛋白质组学技术，进行系统检测和分析，最终确定了VGF、ENPEP等帕金森病（PD）相关蛋白是最具鉴别性的特征蛋白，可以在尿液中作为该疾病的生物标志物。

图5 文献矩形策略示意图

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