标记Taqman探针的常见荧光基团CY3/CY5/3H-吲哚菁/5H-吲哚菁双标记水解探针
TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5'末端,而淬灭剂则在3'末端。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收; PCR扩增时, Tag酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
1. 探针结构
双标记特性:Taqman探针在5’末端携带荧光基团(也称为报告基团),如FAM、TET、VIC、HEX等;在3’端携带淬灭基团,如TAMRA、BHQ等。这种双标记的设计使得探针在完整状态下,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,从而不会产生荧光信号。
探针长度:一般建议探针长度在2535bp之间,但MGB探针(一种特殊类型的Taqman探针)的长度可能更短,通常在1325bp之间。探针的长度会影响其与目标序列的结合特异性和稳定性。
2. 标记原理
荧光共振能量转移(FRET):当探针保持完整时,由于荧光共振能量转移的作用,淬灭基团能够吸收报告基团发射的荧光信号,从而抑制荧光的产生。这种机制确保了在没有目标序列存在时,探针不会产生背景荧光。
水解作用:在PCR扩增过程中,随着DNA聚合酶(如Taq酶)的延伸,当酶遇到与探针互补的目标序列时,其5’-3’外切酶活性会将探针切割成两部分,使得报告基团和淬灭基团分离。此时,报告基团不再受到淬灭基团的抑制,能够发出荧光信号。因此,每扩增一个DNA分子,就会有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成的同步。
3. 应用领域
病原体检测:Taqman探针法荧光定量PCR能够高效、准确地检测病原体,为疾病的早期诊断和治疗提供重要依据。
肿瘤相关基因突变检测:Taqman探针能够精确定量基因表达水平,并有效检测到基因的突变,为肿瘤的前期检测和伴随诊断提供技术支持。
基因多态性研究:通过设计不同荧光标记的探针,Taqman探针法可以实现多重检测,大大节省检测成本和时间,提高研究效率。
4. 注意事项
探针设计:探针的设计需要考虑其长度、Tm值、GC含量等因素,以确保其与目标序列的结合特异性和稳定性。同时,探针的5’端应避免使用碱基G,因为其可能对荧光有一定的淬灭作用。
储存条件:Taqman探针必须避光保存,以防止荧光基团的降解。干粉状态的探针可以在-80℃下长期保存,而溶解后的探针则应在-20℃下保存,并避免反复冻融。
实验操作:在使用Taqman探针进行PCR扩增时,需要注意实验操作的规范性和准确性,以避免非特异性扩增和污染等问题。
荧光素标记透明质酸 FITC-HA
CY5标记透明质酸 CY5-HA18k
吲哚菁绿标记透明质酸 ICG-HA
荧光素标记甲基丙烯酰化透明质酸 FITC-HAMA
CY3标记甲基丙烯酰化透明质酸 CY3-HAMA
荧光素标记海藻酸钠 FITC-Sodium alginate
CY5标记海藻酸钠 CY5-Sodium alginate
CY5-熊去氧胆酸 CY5-Ursodeoxycholic Acid
荧光素标记鞣花酸 CY2-Ellagic acid
荧光素标记胆固醇 FITC-Cholesterol
CY5标记胆固醇 CY5-Cholesterol
CY5.5标记胆固醇 CY5.5-Cholesterol
荧光素标记白藜芦醇 FITC-Resveratrol
CY5标记白藜芦醇 CY5-Resveratrol