实时荧光定量聚合酶链式反应和2-▲CT方法分析相关基因表达数据

实时荧光定量PCR

• 实时荧光PCR，或称实时定量PCR，或称qPCR，是通过对荧光报告基因信号的检测及定量来实现对扩增DNA量的测定，反应过程中荧光信号增长与扩增产物的量成正比。
• 荧光报告基因可被实时荧光PCR仪（荧光检测热循环仪）的光源所激发。通过记录每个循环的荧光发射量，可以监测PCR进入指数增长期的过程，此时PCR产物量首次显著跃升，而此时的PCR产物量与模板起始量是相关的

2-▲▲CT方法的推导

1.描述聚合酶链式反应的指数扩增的方程是

其中Xn是反应循环数为n的目标分子的数量，X0是目标分子的初始数量。Ex是靶扩增的效率，n是循环次数。阈值周期(CT)表示放大的目标量达到固定阈值时的周期数。因此有，
XT是靶分子的阈值数目，CT，X是靶扩增的阈值循环，KX是一个常数。内源性参照(内控基因)反应的一个类似方程式是

式中，RT是参考分子的阈值数量，R0是参考分子的初始数量，ER是参考扩增的效率，CT,R是参考扩增的阈值周期，KR是一个常数。
2.用XT除以RT得到以下表达式

3.对于使用TaqMan探针的实时扩增，XT和RT的精确值取决于许多因素，包括探针中使用的报告染料、序列背景对探针荧光性质的影响、探针切割的效率、探针的纯度和荧光阈值的设置。因此，常数K不一定等于1。假设目标和参考的效率相同,

其中XN等于靶标的归一化量(X0/R0)，▲CT等于靶标和基准(CT,X-CT，R)的阈值周期之差。
4.重新排列给出了这样的表达式

5.最后一步是将任何样本q的XN除以校准样本(Cb)的XN：
校准样本是参照的样本，比如CK下的样本

在这里

对于设计小于150个碱基的扩增产物，并且对其引物和镁离子浓度进行了适当的优化，其效率接近1。因此，相对于校准器，归一化为内源参考的靶量由下式给出

参考文献：Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-
Time Quantitative PCR and the 2-▲▲CT Method

实战运用