硼中子俘获疗法的治疗诊断方法（2021）

硼中子俘获疗法的治疗诊断方法

Theranostics in Boron Neutron Capture Therapy 2021

沃尔夫冈·A·G·索尔文1,2,3,*、露西·桑西4、埃瓦玛丽·海霍金斯1,5、马丁·凯勒特5、路易吉·潘扎1,6、丹妮拉·因佩里奥1,6、马辛·巴尔塞兹克7,8、乔瓦娜·里佐9、伊莉莎·斯卡科9、肯·赫尔曼10、皮尔路易吉·莫里1,11,12、安东内拉·德帕尔马11和安德里亚·维蒂格1,13

1   德国，埃森45122，德国硼中子俘获治疗学会 DGBNCT  e.V.；hey@uni-leipzig.de（E.H.-H.）；luigi.panza@uniupo.it（L.P.）；daniela.imperio@uniupo.it（D.I.）；pierluigi.mauri@itb.cnr.it（P.M.）；andrea.wittig@med.uni-jena.de（A.W.）

2  德国，埃森45147，杜伊斯堡-埃森大学医学院放射治疗系，NCTeam

3  日本，冈山700-8530，冈山大学，中子治疗研究中心

4  法国，拉特隆赫38700，高级生物科学研究所，UGA/Inserm U 1209/CNRS UMR 5309联合研究中心；lucie.sancey@univ-grenoble-alpes.fr

5  德国，莱比锡04109，莱比锡大学化学与矿物学系无机化学研究所；martin.kellert@uni-leipzig.de

6  意大利，韦尔切利13100，东方皮埃蒙特大学法马科科学学院

7  西班牙，塞维利亚41004，塞维利亚塞维利亚大学，医学生理学与生物物理学系；mbalcerzyk@us.es

8  西班牙，塞维利亚41004，塞维利亚大学-CSIC-安达卢西亚董事会，国家加速器中心

9  意大利，塞格拉特9320090，生物医学技术研究所（ITB-CNR）；giovanna.rizzo@itb.cnr.it（G.R.）；elisa.scalco@itb.cnr.it（E.S.）

10  德国，埃森45147，埃森大学医院核医学系；ken.herrmann@uk-essen.de

11  意大利，塞格拉特20090，国家研究委员会（ITB-CNR），ELIXIR Infrastructure，蛋白质组学和代谢组学实验室；antonella.depalma@itb.cnr.it

12  意大利，比萨56127，圣安娜斯库拉高级生命科学研究所

13  德国，耶拿07743，弗里德里希·席勒大学耶拿，耶拿大学医院，放射治疗和放射肿瘤学系

*通信：wolfgang.sauerwein@dgbnct.de

摘要

硼中子俘获疗法（BNCT）具有特异性破坏肿瘤细胞的潜力，而不会破坏肿瘤未浸润的组织。BNCT是一种二元治疗方法，基于两种组分的结合，即10B和热中子，单独使用时没有效果。仅此而已，两者的结合产生效果，其程度取决于肿瘤中10B的量，也取决于危及器官。目前尚不可能使用非侵入性方法确定特定组织中的10B浓度。目前，只能测量血液中的10B浓度，并假设血液到组织的10B吸收是固定的来估计组织中的硼浓度。在这种不精确的假设下，BNCT很难进一步发展。一种诊疗方法，将用于治疗目的的硼载体与成像工具相结合，可能允许我们使用非侵入性方法测定特定组织中的10B浓度。这篇综述总结了目前的临床方案和临床前实验，以及硼给药系统创新药物开发如何结合同时成像的结果。最后一节重点介绍了蛋白质组学对BNCT进一步优化的重要性，让BNCT成为一种高度精确和个性化的治疗方法。

关键词：BNCT；放射肿瘤学；小分子；BSH；BPA；PET；定量MRI；图像配准；细胞穿透肽CPP；蛋白质组学

Keywords: BNCT; radiation oncology; small molecules; BSH; BPA; PET; quantitative MRI; image registration; cell-penetrating peptides CPP; proteomics

1  简介：什么是BNCT，为什么需要进一步发展这种模式？

硼中子俘获疗法（BNCT）是一种靶向疗法，其原理是基于同位素10B的性质，以高概率（高有效截面：3835 b）俘获热中子，通过俘获反应10B(n,α)7Li衰变为He和Li核。如果这种反应发生在组织中，两种粒子由于其高线性能量转移（LET）特性而有效地破坏细胞。由于两种粒子在组织中的射程较短（约5-9微米），细胞损伤几乎完全局限于含有10B原子的细胞。含有少量或不含硼的相邻细胞不会受到损坏。因此，如果10B可以通过合适的转运分子选择性地富集在肿瘤细胞中，则可以在保留健康组织的同时靶向破坏恶性细胞[1]。

因此，BNCT的想法是实现高度个性化的肿瘤治疗，将治疗效果仅限于患者特异性肿瘤扩散。将这一原理发展成为一种治疗选择需要一种化合物，该化合物选择性地但浓度足够高，在所有肿瘤细胞的细胞核内或细胞核附近积累10B，但对健康细胞无毒，并且对全身无毒。这种二元治疗的两个单独组分，即合适的含10B的化合物和低能中子，本身很小或没有生物效应。只有两种成分的组合才能触发硼中子俘获反应，从而产生治疗效果。

将这一原理发展为治疗方式具有挑战性[2]，因为BNCT在患者体内应用的照射剂量以及BNCT的效果取决于不同组织中10B的量。更重要的是，BNCT不仅通过限制恶性细胞的抗肿瘤作用而具有高度精确性，而且还具有高度个性化：（i）通过特定靶向机制摄取10B取决于单个肿瘤细胞的分子特征，（ii）辐射剂量取决于单个细胞中10B的浓度，（iii）空间剂量分布取决于亚细胞10B 分布和（iv）药物应用和照射的最佳时间点取决于10B递送剂的患者特异性药代动力学和药效学（照射必须发生在肿瘤细胞中10B浓度最高，健康组织中最低的时间点）。因此，成像和测量这些高度个体依赖性的可能性是BNCT进一步发展的先决条件。

目前，技术上无法在照射时确定组织中的10B浓度。根据实验确定的因素，完全可以测量血液中的10B浓度，并假设每个患者的组织（无论是肿瘤还是危及器官）中的累积是相同的。对于目前用于BNCT临床应用的两种化合物[3]，即BPA（10B-p-硼代苯丙氨酸，C9H1210BNO4）[4]和BSH（巯基十一氢闭式十二硼酸钠，Na210B12H11SH）[5]（图1），这些因素已经在健康组织中确定，因此在临床试验的狭窄范围内安全应用BNCT似乎是可能的。然而，完全缺乏更大的对照前瞻性研究。众所周知，单个个体以及不同患者之间肿瘤组织的异质性使得不可能准确估计剂量，因此无法预测预期效果。

 图1 BNCT临床应用中目前使用的两种化合物（a）10B-对-硼苯基丙氨酸（BPA），（B）巯基十一氢闭式十二硼酸钠（BSH）[3]

最近在医院中出现的基于加速器的BNCT设施使得该模式独立于核研究反应堆，因此可用于常规临床使用[6]。这一不断发展的市场使得开发新型硼化合物成为当务之急[7,8]。

治疗诊断方法提供了克服这些挑战并使 BNCT 成为真正的精准治疗的潜力。术语“治疗诊断方法”用于结合治疗和诊断成像方式的材料。一种化合物，在治疗过程中可以作为10B的传递剂，也可以用于诊断宏观10B分布的诊断成像并可能允许量化，可以极大地帮助进一步发展。实际上，在过去的70年中，这一原理已被用于甲状腺肿瘤的治疗[9]。最近核医学中最成功的治疗概念包括肽受体闪烁显像术（PRS）和肽受体放射性核素治疗（PRRT），用于成像和治疗癌症，例如神经内分泌肿瘤[10]。

BNCT 的第一个治疗诊断策略已用于化合物 BPA，本文第 3 节将对此进行更详细的讨论。

2  用于治疗优化和反应评估的多模式成像

出于几个原因，医学成像应该在BNCT治疗的计划和评估中发挥相关作用。它可以帮助评估到达靶区位置的硼化合物的量；此外，创建患者模型来计算中子与组织元素的核相互作用是必不可少的，最后，有必要评估治疗对肿瘤和正常组织的影响。

磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT）成像是治疗计划、处方和治疗反应评估中最常用的成像方式。本节重点描述当前使用医学成像进行治疗优化和反应评估的情况，并概述未来的前景。

2.1  BNCT治疗计划的医学图像配准

BNCT中的治疗计划基于创建患者模型，该模型包含患者几何形状内组织的元素组成。这对于计算中子与组织的核相互作用是强制性的。为此，通常考虑治疗前获得的患者的CT图像，最终与MRI或PET结合，以准确识别靶区体积和危及器官（OAR）。在这种情况下，采用医学图像配准，即位移矢量场的估计，将不同的图像采集重新对齐到CT识别的参考坐标系，并恢复治疗计划和治疗实施之间可能发生的空间变形。这与自适应规划特别相关，考虑到几何形状的变化，重新计算输送剂量[12]。

Sato等人在2019年[13]描述了用于BNCT治疗计划的典型图像配准方案，证明了截面厚度和视野（FOV）设置对计算的热中子通量和超热中子通量的影响，从而估计了剂量。需求患者定位对剂量计划的热/超热中子通量估计的不可忽视的影响突出了空间重新排列的重要性。据报道，治疗过程中患者位置的改变，特别是通过摆位，对剂量估计有相关影响[14] 。事实上，与传统的放射疗法不同，BNCT中没有复杂的患者定位工具。此外，成像期间和治疗期间的定位可能非常不同，因为必须将患者直接带到刚性射束输送系统。研究发现，肿瘤平均剂量的降低是由于移动距离过大所致，而脑肿瘤在更深处的剂量分布对患者的运动更为敏感[14]。

图像配准算法的选择取决于要重新对齐的成像模式（单峰与多峰）以及要恢复的变形类型和数量（刚性与可变形配准）。如果可以准确地重复患者的定位并且没有生理运动，那么在大多数情况下，如在脑肿瘤中，刚性配准将是足够的；否则，弹性变形的估计将更合适。无论如何，图像配准方案应该始终针对解剖区域和可用的医学图像类型进行优化。

2.2  BNCT反应评估的医学影像：当前使用和未来前景

目前，通过遵循实体瘤反应评估标准（RECIST）的定性或半定量测量，使用传统成像（如CT，T2w MRI和T1w MRI）在注射基于Gd的造影剂之前和之后评估BNCT治疗的效果[15]。用于评估肿瘤对治疗反应的典型指标和放射学测量是肿瘤体积的变化、Gd-MRI上的增强区域和T2w-MRI上的强度[16,17]。用这种方法，在临床前大鼠模型中评估治疗效果[18]。在患者中，评估了BNCT在接受高级别胶质瘤治疗的患者[16,17,19,20]、患有头颈部癌（HNC）的患者[21]的治疗效果，以及评估了脑肿瘤治疗患者的不良反应[22,23]。Hiramatsu等人[24]通过使用功能扩散图（fDM）评估脑肿瘤的反应，朝着引入更多基于图像的定量指标来评估治疗反应迈出了一步。这种方法基于对逐个体素表观扩散系数（ADC）随时间变化的评估，如扩散加权MRI（DW-MRI）估计。这些定量图的加入使BNCT治疗的胶质母细胞瘤的反应模式比标准放射学评估更早。

在常规放疗中，一些研究已经提出使用基于定量图像的生物标志物来评估治疗反应，以利用医学成像的信息内容。例如，先进的功能性磁共振成像技术，如扩散加权和灌注加权磁共振成像，突出了在确定高级别胶质瘤的预后和预测治疗反应方面的巨大潜力[25]。根据动态对比增强（DCE）MRI、动态敏感性对比（DSC）MRI和DW-MRI的数学模型得出的系数估计，可以直接量化扩散和灌注特性，这些特性与生理和生物学特性直接相关。甚至可以使用更先进的技术，这些技术基于能够描述扩散和灌注相关微观结构组织特性的定量模型，例如体素内非相干运动（IVIM）[26]和扩散张量成像（DTI）[27]。通过IVIM采集，可以研究灌注对DWI的相关影响。这项技术的有效性已经确定，用于评估不同肿瘤对放疗的反应，包括HNC[28]。DTI被用于脑肿瘤的诊断，预后和治疗反应的预测[29]。PET和MRI[18F]FDG PET/MRI的同时结合已被证明在检测患有一些特殊的头颈部恶性肿瘤患者的局部复发和转移方面优于MRI[30]。它也可能为BNCT的创新治疗提供另一种方法。

获得组织空间组织定量描述的最新发展是所谓的影像组学，即自动高通量提取医学图像的大量定量特征（图2）。影像组学现在主要用于肿瘤学，揭示了肿瘤诊断和反应评估的巨大潜力。此外，放射学特征可以很容易地与灌注和扩散成像中基于定量图像的生物标志物相关联，从而对组织进行详尽的多参数表征。这样，可以联合考虑结构和功能特性，以获得更准确的预测模型[32]。

 图2 影像组学分析的示意图流程。（1）医学图像上感兴趣区域（ROI）的识别；（2）在ROI内提取影像组学特征（体积、基于直方图、纹理和基于的滤波器）；（3）预测和预后的特征选择和模型构建

这些先进的技术可能在BNCT的背景下具有创新性的应用，以评估治疗对肿瘤的效果以及治疗对周围组织的影响：此外，使用影像组学估计的肿瘤异质性可以提供有用的信息来优化治疗在通往精准医学的路上。先前需要进入研究反应堆阻碍了BNCT治疗的患者招募，并严重限制了对照前瞻性临床试验的数量。这也阻碍了已经被纳入常规放射治疗工作流程的先进医学成像技术的采用。数据的缺乏使得无法可靠地评估基于定量图像的生物标志物在这种情况下可能带来的有效改进。随着最近出现的BNCT医院中子源，现在可以进行更大患者队列的前瞻性研究，并应包括评估多模态定量成像，以评估治疗反应，以提供一个稳健的研究。这也为进一步开发针对BNCT的方法开辟了可能性，在早期阶段显示出临床应用的前景[33-36]。

3  BPA和[18F]FBPA：BNCT中现有的第一种治疗诊断方法

在本节中，我们将重点介绍正电子发射断层扫描（PET）作为诊断工具的使用，以确定硼化合物在组织中的分布，用于患者选择、治疗计划以及使用BPA作为10B化合物的BNCT的可能剂量监测。这种药物是由三岛在20世纪80年代末引入BNCT的[37]。BPA主要由L型氨基酸转运蛋白（LAT-1）吸收。1991年，Ishiwata等人提出了4-10B-硼酸-2-18F-氟-L-苯丙氨酸（[18F]FBPA），用于在BNCT之前监测BPA的药代动力学（图3）。20世纪90年代末，美国的W. Kabarka等人[40]和日本的Y. Imahori等人[41,42]通过PET对其在体内的药代动力学和患者体内BPA的定量进行了研究。

 图3 18F标记的FBPA的分子结构（参见图1）

Imahori等[41]报道了一种基于[18F]FBPA的定量测量高级别胶质瘤患者硼化药物摄取的方法。使用三室模型分析PET数据并评估肿瘤药理学。肿瘤中的硼浓度用该模型计算的浓度接近手术样品中测得的浓度。使用分段折叠方法评估L-BPA和标记类似物之间的药代动力学一致性。作者得出结论，BPA 10B浓度的估计值可以通过四速率常数模型（four-rate constant model）计算得出，该模型适用于PET使用[18F]FBPA作为示踪剂的动态研究。通过这种方法，在BPA给药后用BNCT治疗的患者的中子照射之前评估10B浓度。按照类似的方法，[18F]FBPA已被用于测量其在如下肿瘤中的摄取，如转移性恶性黑色素瘤[40]、神经鞘瘤和脑膜瘤等低度脑肿瘤[43]、头颈部恶性肿瘤[44]、口腔复发癌和颈部淋巴结转移[45]、以及恶性胶质瘤[46]。这些早期的临床发现与[18F]FBPA/PET导致了对BPA的输运、净流量和累积的研究，并显示了PET筛选不同类型和不同级别的肿瘤病变作为BNCT候选者的能力[44,45]。

目前，在BNCT中使用PET/CT和[18F]FBPA是为了评估个体患者肿瘤相对于周围正常组织的[18F]FBPA摄取，并将此信息视为BNCT有效性的替代指标。这些数据可以用作临床试验中患者选择的纳入/排除标准，以避免由于个体患者肿瘤中10B摄取不足而导致的治疗失败[44]。然而，尽管这些信息可能有助于选择BNCT患者，但目前还没有证据证明PET摄取[18F]FBPA与BNCT后临床结果的相关性。

由于各种原因，这种BPA/[18F]FBPA方法还不是BNCT中真正的治疗诊断解决方案的理想解决方案。首先，BPA和[18F]FBPA是不同的分子，即使它们都通过LAT系统转运到细胞中。然而，更重要的是，PET诊断只需要 µg的[18F]FBPA，而治疗需要几克BPA。由此产生的药效学变化尚未得到充分研究，目前的方法也没有考虑到。2020年5月，日本监管局批准BPA溶液作为药物（Steboronine®，Stella Pharma Corporation，Chuo ku，Osaka，Japan），但FBPA没有批准。在临床试验的框架下，只有在BPA之前的常规手术中，才可能对BPA进行指示性治疗前诊断。

BNCT新硼载体的设计应从一开始就应考虑这些方面，并在合适的分子中提供原子，这些原子的非放射性同位素可以被正电子发射体取代。对于治疗，可以将少量放射性形式添加到真正的治疗剂中，从而能够更精确地确定个体药代动力学、体内硼的分布以及治疗期间组织中的硼浓度。

18F以外的其他放射性同位素可能与含硼化合物偶联，从而可以在临床前研究中对其进行跟踪和定量。几种金纳米粒子用碘（123I[48]或124I[49,50]）标记用于小鼠研究。68Ga[51]和64Cu[50]也可以替代18F。研究了64Cu-PLGA胶束在具有非常高的肿瘤/健康组织比率的皮下黑色素瘤中矢量化10B，从而在BNCT后提供延长的存活期[52]。与精氨酸肽融合的BSH衍生物用64Cu标记，由于添加了促进细胞内化的精氨酸，显示出有希望的脑肿瘤摄取。

4  BNCT治疗诊断方法的进一步诊断可能性

由于可以进行定量全身检查，PET扫描是监测和量化治疗计划中放射性标记硼化合物的金标准成像方式，即在BNCT之前。在BNCT治疗期间，根据先前的分布分析，测定血液中的硼浓度并外推到肿瘤和周围组织中。目前，还没有实时方法来量化中子照射期间患者个体的硼含量。

总之，PET是监测10B累积的间接工具。化合物的稳定性很重要。在造影剂的设计和合成中，一个重要的方面是放射性同位素所需的稳定共价结合或该同位素与载体分子产生非常稳定的复合物，以防止放射性同位素污染患者。

到目前为止，PET扫描被用于追踪18F放射性标记的BPA。然而，19F可以替代放射性同位素18F，并且可以使用磁共振（MR）成像或MR谱仪来观察血液样品。为了BNCT的目的，已经描述了一些关于体模[54]或啮齿动物[55]的研究。Timonen等人报道了芬兰对2例脑肿瘤患者的可行性研究，证明了使用MRI定位[19F]FBPA[56]存在一些困难。本研究应包括更多患者，以总结在患者输注BPA溶液前后进行此类调查的相关性[11]。

原则上，MRI成像和MRI光谱学也可用于检测当前可用的硼化合物，即BSH和BPA，尽管这需要特殊的软件和硬件要求，而这些要求目前尚不可用于临床[33-36]。

更一般地说，MRI用于监测BNCT前后的肿瘤体积[57]。然而，一些临床前研究也报道了检测到含有B和Gd或Fe的化合物作为新一代BNCT治疗诊断化合物。据报道，由GdBO3-Fe3O4制成的纳米复合材料在体外作为磁靶向治疗、磁共振成像/诊断和中子俘获治疗的创新剂[58]。最近，Alberti等人描述了一种与碳硼烷笼结合的Gd螯合物，赋予LDL以生成25 nm大小的靶向纳米制剂，能够选择性结合LDL受体，LDL受体在各种肿瘤细胞上过度表达，例如肺肿瘤[59]和恶性间皮瘤（MM）细胞。这种纳米制剂使他们能够进行MRI引导的BNCT，与对照组相比，MM尺寸减少了85%[60]。其他多模式靶向制剂已被描述为在啮齿动物的胶质母细胞瘤细胞中特异性积累。Kuthala等人报道的靶向整合素αvβ3的90 nm大小的纳米颗粒通过MRI和光学成像进行追踪，从而延长了携带脑肿瘤的动物的存活时间[61]。在临床前阶段，研究了aza-BODIPY衍生物以增强BSH在肿瘤中的矢量化。虽然目前在SWIR区域通过光学成像可视化，但aza-BODIPY衍生物也可能被添加一种小的螯合物以修饰，如DOTA部分，可用于核成像[62]。

在活体外，也可以使用元素成像对硼在组织中的定量和分布进行研究。使用二次离子质谱（SIMS）[63]、激光二次中性质谱（laser secondary neutral mass spectrometry，laser SNMS）[64,65]或激光诱导击穿光谱（LIBS）[62]，这些模式可能会在细胞和组织尺度上提供一些额外且有价值的信息。LIBS是一种在室温和大气中工作的全光技术，可以从样品的地图中重建元素成像。在LIBS中，通过将激光脉冲聚焦在样品表面而产生的激光诱导等离子体允许从构成样品的元素中激发特定的光学响应。在以逐像素的方式重建地图之前，使用光谱仪收集这种特定的响应[66-68]。真正的亚细胞检测细胞中的10B可以通过电子能量损失谱（EELS）实现[69,70]。中子放射自显影[71,72]是绘制器官10B分布的一种成熟方法。Wittig等人总结了2008年应用于BNCT的这些方法[73]。

5  BNCT中具有治疗诊断应用的分子模式

5.1  小分子

对于癌症治疗，有必要了解和研究恶性组织的尺寸和各种其他特性，以适应计划的治疗。特别是在BNCT中，一个非常重要的方面是在患病组织中检测、正确定位和定量10B，以指导放射治疗。因此，开发可用于体内治疗和诊断目的的小分子，即所谓的治疗诊断剂[74-76]，非常重要。

基于这种双重方法，将各种潜在的小分子BNCT试剂与显像剂缀合。对于治疗应用，相应的药物应作为肿瘤选择性化合物，并允许癌细胞中硼的高积累，以及表现出BNCT药物所需的所有其他特性。

对于诊断，主要使用PET和MRI进行体内成像。

放射性标记的化合物 [18F]FBPA（见第 3 节）（图 3）是最常用的 BNCT-PET 治疗药物 [78]。 其他几种小分子（类似 [18F]FBPA）也可用于该方法，例如 2019 年报道的改性硼衍生酪氨酸、氟硼酸酪氨酸 FBY（图 4）。FBY 是一种酪氨酸类似物，其中 COOH 基团被 BF3 部分取代，被提议作为治疗诊断剂 [79]。与BPA相比，FBY显示出优异的化学稳定性，放射化学产率高达50%，放射化学纯度高达98%。其与天然氨基酸酪氨酸的相似性使其能够通过LAT-1系统摄取，因此可以累积多达128 µg FBY/10^6个细胞。通过向小鼠施用[18F]FBY，然后进行PET成像，表明了非侵入性成像的可能性。此外，FBY没有明显的全身毒性，这使得该化合物成为一种很有前景的图像引导BNCT治疗剂[79]。一项针对六只动物的小型临床前研究比较了BPA和FBY，结果显示，在静脉注射FBY和BPA 1 g/kg，接受10^12 n/(cm^2s)中子通量照射30分钟，BNCT后3周，FBY的动物存活率和肿瘤大小略好。将肿瘤置于小鼠的右肩。没有关于FBY的动力学数据[79]。

图4 Tyr和FBY的分子结构比较

然而，主要在体外应用的另一种成像方法是荧光成像。一种也用于体内成像的治疗诊断剂是带有六个碳硼烷单元的哑铃形或H形分子，用于肿瘤靶向的非肽RGD模拟αvβ3整联蛋白配体和用于荧光成像的一种甲基花青染料（DC-1，图5）。该化合物显示在利用αvβ3整联蛋白靶向单元的MCF7（乳腺癌）和WM115（黑素瘤）细胞中积累。通过体内荧光光谱和活体显微镜（IVM）实现摄取的可视化[80]。虽然这种化合物是一个单分子，但约1.2 kDa的分子量不允许将其归类为小分子[81]。

图5 荧光成像用碳硼烷、非肽类RGD模拟αvβ3整合素配体和一种甲基菁染料组成的哑铃状分子[80]

5.2  用于BNCT的细胞穿透肽（CPP）

CPP是短肽（少于30个氨基酸），在过去30年中主要用于基础和临床前研究。它们不仅能够将自己转移到细胞中，而且还可以促进“货物”部分，从纳米颗粒到小化合物，主要通过各种内吞机制转移到质膜上。货物通过共价键或非共价相互作用与CPP连接。几位作者正在研究CPP是否可以作为一种递送系统，在体外和体内将硼化合物携带到癌细胞中以进行BNCT[83-86]。

这项研究的重点是BSH（图1），对于含有多个硼原子的BNCT化合物来说是非常理想的，这使得10B的输送更加有效。然而，这种化合物有一个显着的缺点，因为由于硼簇的负电荷，它不容易直接穿过细胞膜。为了克服这个问题，将寡精氨酸肽与带有多个BSH部分的树突赖氨酸缀合。与单独的BSH和其他BSH-CPP缀合物相比，含有八个BSH单元的结构在U87神经胶质瘤细胞上进行了体外测试，显示出明显的摄取。对注射到裸鼠纹状体中的相同U87细胞的体内研究表明，该化合物积累到肿瘤中，但在正常大脑中未检测到。

在一种完全不同的方法中，一系列已知能够穿过膜穿透细胞的棕榈酰肽与BSH结合，其中两种结构被鉴定为在T98G胶质母细胞瘤细胞内有效积累硼。

将与短寡精氨酸结构域融合的BSH与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）缀合，并用正电子发射体64Cu标记（图6）。正电子发射断层扫描被允许在携带U87δEGFR脑肿瘤的小鼠体内追踪该化合物的药理学。值得注意的是，这是基于CPP的治疗诊断BNCT构建体的唯一例子。迄今为止，只有少数CPP的18F标记例子[87]，但在BNCT领域没有。

图6 基于CPP的BNCT治疗诊断构建体[53]。64Cu处的三叶符号表示该分子的放射性元素

冈山大学中子治疗研究中心的同一小组开发了另一种BSH寡精氨酸构建体，显示其与CD44细胞表面分子结合以进行细胞摄取[88]。

合成并测试了与硼簇BSH缀合的具有高质膜透性的细胞器靶向细胞穿透肽。这些产品旨在控制它们在细胞内的位置，特别是靶向线粒体和核内体。为了追踪细胞内分布，用荧光探针标记构建体。该研究使我们能够可视化带有不同CPP的缀合物的特定亚细胞分布。此外，在用热中子照射后，其中一种产物显示出高细胞杀伤活性。对细胞死亡途径的研究表明，细胞凋亡标志物的增加和ATP含量的降低，从而有助于理解接受BNCT治疗时细胞死亡的机制。

5.3  较大的硼载体：蛋白质、抗体和纳米颗粒

产生了较大的硼载体，如蛋白质、表皮生长因子（EGF）、抗体（单克隆抗体；mAb）和纳米颗粒，以提高选择性和大量10B的递送。由于它们的大小，这些化合物有助于使用18F、123I、111In、64Cu、68Ga和177Lu进行核成像的放射性标记，或者添加Gd进行MRI研究。

白蛋白作为单分子和纳米粒子载体广泛用于肿瘤学，因为它通过增强的通透性和保留（EPR）效应在肿瘤病变和炎症组织中积累，并具有多种细胞受体和配体结合位点。这种丰富的蛋白质（人体血液中为35-50 mg/mL）具有疏水结合口袋，可促进疏水分子的运输。可以评估不同的策略以进行有效的肿瘤递送，包括纳米颗粒制剂、共价结合和基因融合。在BNCT方法中，据报道马来酰亚胺闭式十二硼酸盐与白蛋白赖氨酸（Lys221、Lys413和Lys431）和半胱氨酸Cys34残基的共价缀合在结肠癌26荷瘤小鼠中选择性积累；当用作BNCT的硼载体时，这种分子在低剂量（7.5 mg[B]/kg）下表现出强烈的肿瘤体积减少[90]。

另一个生物学靶点，表皮生长因子受体（EGFR），在高级别胶质瘤（一种可能用BNCT治疗的肿瘤类型）上过度表达。涉及硼化星形树枝状大分子（BSD）的富硼化合物已与mAb抗EGFR缀合。硼酸盐单克隆抗体偶联物（BD-C225）在体外表达EGFR的肿瘤细胞中表现出特定的累积。在体内，瘤内注射[91]和对流增强递送（CED）给药[92]在24小时内表现出延长且有利的肿瘤保留（表达EGFR的肿瘤中CED>50 µg/g），其中肿瘤/大脑比率≈10。有意义的是，当CED给予BD-C225后24小时进行BNCT时，平均生存时间（MST）达到54.1天，并与静脉注射BPA（500 mg/kg）联合使用增加到86天[93]。作为对照，未给药物经照射的动物的MST为30.9天。总之，这些研究证明了靶向分子的潜力以及与临床批准的BPA联合治疗的有效性。

在这些研究中，未使用成像在体内对硼载体进行定量，但报道了离体定量以优化BNCT效果；然而，白蛋白[94]和抗EGFR[95]的标记都可以用于成像和治疗计划。

在其他情况下，纳米特定实体被用作肿瘤选择性载体，如携带具有64Cu同位素的硼化卟啉复合物的生物相容性聚合物纳米颗粒（用于PET，图7），或用于含有碳硼烷的胆固醇衍生物的脂质体，带有GdIII复合物（用于MRI，图8）[96]。

图7 纳入生物相容性聚合物纳米颗粒的含铜硼卟啉[52]）。64Cu处的三叶符号表示该分子的放射性元素         

图8 含有GdIII和碳硼烷的胆固醇衍生物，用作具有MRI成像能力的脂质体前体[96]

相变溶菌酶包覆氮化硼纳米颗粒(PTL@BNNP)在静脉注射维生素C后诱导体内降解，制备成BNCT试剂（图9）[97]。4T1细胞中的细胞摄取达到200 ppm硼（10 mM）。这些纳米粒子用PET放射性同位素标记，即64Cu，通过简单地将64CuCl2与PTL@BNNP在0.1 M盐酸中，转移到醋酸钠缓冲溶液中，然后进行超滤，以便在加热前进行净化。BNCT治疗对一小组（n=6）肩部接种4T1肿瘤的动物有效。动物存活3周；然而，肿瘤不断生长。

图9 用相转移溶菌酶包被的BNNP的制备的示意图。经Li L等人许可转载。ACS Nano.，2019年；13(12)：13843-52(97)。版权所有（2019）美国化学学会

合成了涂有富硼钴双（二羧基）阴离子并（cobalt bis(dicarbollide)anion）用聚乙二醇稳定的金纳米颗粒（NP）（图10）[49]。NP在NP表面和钴双（二羧基）外围（半衰期4.18天）成功标记124I，用于PET成像。在人纤维肉瘤（HT1080细胞）的小鼠模型中的掺入达到0.06 mM，这对于BNCT来说太低了。另一方面，在人类纤维肉瘤异种移植小鼠模型中的生物分布研究表明，肝脏、肺和脾脏中有大量积累。这些结果表明，有必要进一步优化金纳米粒子的形状和尺寸，预靶向可能是一种选择[98]。

图10 在碳硼烷外围具有124I标记的钴双（二羧基）修饰的金纳米粒子的实例

最近，Feiner等人[98]研究了一种使用超小纳米颗粒（富硼碳点）的预靶向策略，以减少正常纳米载体应用期间长循环时间引起的脱靶副作用（off-target side effects ）。他们描述了四嗪功能化富硼碳点的制备、表征和体内评价。这些微粒与血液的清除速度很快。通过使用预靶向方法实现肿瘤聚集，这是通过在肿瘤部位与反式环辛烯功能化曲妥珠单抗发生高度生物正交反应来实现的。作者还展望了将探索的方法转移到其他基于靶前治疗的方法，以减少靶外副作用，例如放射性核素治疗。对所提出方法的方案进行修改，为制定新的治疗策略奠定了基础，这可能会提高市场上现有治疗方法的疗效。

6  预测结果的蛋白质组学

在过去的二十年中，基因组学，包括基因组和转录组的分析，在翻译研究中获得了强大的推动力。这些方法有可能导致高度创新和雄心勃勃的项目，对理解疾病发展和治疗干预的效果具有巨大的附加价值。蛋白质组学在短期内对治疗学将变得越来越重要，因此有必要在这里提及。

高通量分子方法（也称为“组学技术”）的主要目标涉及：

●     发现和验证可用于诊断和治疗随访的生物标志物；

●     表征所研究疾病中涉及的代谢途径；

●     阐明与疾病病因和临床分层相关的分子机制（内型）。

组学技术与计算工具相结合，允许开发面向系统的方法，称为系统生物学，或应用于临床领域的系统医学[99]。

尽管基因对生命至关重要，但它们不足以解释决定表型的环境影响。众所周知，基因组并不是完全静态的；然而，蛋白质和代谢物作为基因的分子效应物，对各种刺激更敏感，并且它们放大了与疾病相关的损伤。此外，由于选择性剪接和翻译后修饰（PTM），多种蛋白质与单个基因或mRNA相关。事实上，据估计，大约有25000个基因，40000个独特的代谢物，约100000个mRNA转录本和超过一百万种不同的蛋白质异构体。

由于这些原因，必须超越基因组/转录组的主要研究，加强蛋白质组和代谢组的研究，以了解疾病的分子基础，作为准确诊断和有效治疗的先决条件。

质谱和色谱技术的改进构成了高通量蛋白质组学方法的基础，正在提高蛋白质组学谱的精确度，减少分析所需的样品量。这将能够克服合并样本的使用，这是真正个性化医学的强制性要求[100]。鸟枪蛋白质组学是定量的，基于不同的方法来评估蛋白质在不同条件下的差异表达[101]，并且可以分析多种样品：细胞系、生物流体和组织，新鲜的、冷冻的或石蜡处理的；特别是，分析福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品的可能性提高了可用于蛋白质组学分析的人类样品的可用性。

从患者身上采集的样本的可用性是最重要的关键问题之一。原则上，疾病所在组织的活检以及分子标记更常见和更特异的组织活检是研究人类疾病的最佳样本。然而，收集与疾病相关的组织并不总是容易或可能的，例如在大脑中。这需要开发方法来研究在没有侵入性程序的情况下获得样品，例如细胞系和生物流体（主要是血液或尿液），以鉴定分泌的蛋白质作为生理病理状况的潜在生物标志物。称为类器官的三维培养物也代表了接近实际癌症组织的良好模型。

生物流体通常很容易收集。它们含有潜在的疾病相关信号，但与患病组织中的样品相比，这些特征被大量少数蛋白质（主要是血浆中的白蛋白和免疫球蛋白）高度稀释或超载。通过分离循环微泡（mEV）（也称为外泌体），可以将信号与基线生化噪声分开。它们被认为是载体，含有各种分子，如代谢物、RNA和蛋白质，它们从特定组织中转运分泌的信号（分泌蛋白组），类似于“瓶中的信息”。显然，mEV对于癌症诊断和监测非常有意义，因为它们可以在没有侵入性干预的情况下反映受损或恢复组织的变化。

临床蛋白质组学的另一个重要问题是确定疾病中失调的途径；因为它不是疾病中改变的单个蛋白质，而是代表一种途径的一簇相互作用的蛋白质。因此，鸟枪蛋白质组学产生的大量数据可以通过计算工具进行处理，以将蛋白质谱与生物过程相关联，通过系统生物学策略匹配临床表型和蛋白质组学数据，并改进实际的个性化医学。

蛋白质组学被广泛用于研究肿瘤生物标志物和内型，如能量代谢的作用。相比之下，很少有应用与硼中子俘获疗法（BNCT）有关。Sato等人通过基于凝胶的蛋白质组学研究了BNCT对中子照射前用BPA孵育的人鳞状细胞癌SAS细胞的影响[104]。结果表明，LRMP（淋巴限制性膜蛋白）是BNCT的特异性蛋白，可能在BNCT诱导的细胞死亡过程中发挥生理作用。最近，Ferrari等人在一项早期临床试验中，使用无凝胶方法对头颈部鳞状细胞癌和甲状腺癌患者在肿瘤切除前分别接受过BPA和BSH的泌尿系外体蛋白谱进行了表征。BPA和BSH治疗均能降低与炎症和肿瘤进展过程相关的蛋白质水平，包括CD44、半乳糖凝集素-3结合蛋白和骨桥蛋白。最后，BSH在体外通过半胱氨酸与蛋白质结合[106]。

特别是，BNCT作为一种创新的肿瘤靶向治疗，可以利用分子剖析的方法体系来提高对新型含硼化合物及其与中子照射的结合作用的理解。因此，有资格获得BNCT治疗有益效果的患者的分型成为可能。这将通过避免无效疗法来降低成本，从而有助于为特定患者选择最佳治疗方式，这是个性化医疗的最终目标。

特别是，通过使用非侵入性样品，可以研究与疾病相关的精确分子特征和破坏的信号通路的表征，并评估治疗的效果和副作用。

虽然分子谱方法，主要是蛋白质组学和代谢组学方法，并不完全符合治疗诊断活动的定义，但它们可以对治疗结果进行高精度的诊断分型和个性化预测。特别是，基于蛋白质组学的系统生物学研究能够阐明与发病机制和/或治疗的积极作用相关的内型。最近，Rainone等人[108]使用蛋白质组学来证明靶向纳米颗粒作为新的治疗诊断剂的特异性和有效性。在这种情况下，有可能在治疗诊断活动中包括蛋白质组学的可用性，以分析非侵入性样品，并表征与肿瘤侵袭性相关的分子靶标，而不仅仅是小分子。

显然，实际使用蛋白质组学来改进BNCT以开发治疗诊断方法将需要密切结合来自非常不同学科的技术，例如用于离体实验的类器官和3D生物打印，以及创新成像，包括数据处理评估（参见本文第2节的放射组学）。将来，所有生成的数据的组合将使临床医生能够获得个体患者的更详细的资料，以进一步个性化精准医学。

7  结论

BNCT是精确医学的一种治疗方式[109,110]。它的成功取决于针对特定患者的剂量应用的优化定制。为了充分发挥BNCT的潜力，一个挑战是使用组学方法来识别生物标记物，从而确定适合特定靶向10B携带剂的患者亚群。本文第3节中描述的18F标记BPA的方法是解决这个问题的第一步。然而，这种方法并不充分，因为它不能捕捉肿瘤和个体的异质性硼载体摄入靶细胞的动力学。为了最佳地使用BNCT，必须找到方法尽可能精确地评估与照射直接相关的肿瘤和危及器官中的硼浓度。治疗诊断方法原理提供了实现这一目标的可能性。应事先设计新的硼载体，以便在照射之前（甚至在照射期间）直接确定它们在体内的分布及其在特定组织中的浓度。

目前正在进行研究，以确定具有更好的肿瘤选择性，更长的细胞保留时间，并且可以通过各种技术监测其在患者内部器官中的积累的BNCT的新候选者，重点聚焦在PET上。4-10B-硼-2-18F-氟-l-苯丙氨酸（[18F]FBPA）是第一种用于监测4-10B-硼代苯丙氨酸药代动力学的化合物，该化合物仍用于BNCT。MRI可以替代用于监测BNCT治疗前后的肿瘤，不同的临床前研究报道了检测到含有B和Gd或Fe都是新一代治疗诊断BNCT药物。主要应用于体外的荧光成像发现了非肽RGD模拟整合素配体和花青染料在体内BNCT中的应用。另一种方法是BSH与CPP的结合。BSH时，链接将短寡精氨酸肽与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）偶联，并用正电子发射体64Cu标记，通过PET可以在U87△EGFR脑肿瘤小鼠体内监测该化合物。蛋白质、生长因子、抗体和纳米粒子被结合以提高选择性和大量10B的递送。当马来酰亚胺闭式十二硼酸盐与白蛋白赖氨酸和半胱氨酸Cys34残基连接时，该化合物在结肠癌26荷瘤小鼠中选择性积累。硼酸酯-单克隆抗体缀合物（BD-C225）在体外表达EGFR的肿瘤细胞中表现出特定的积累。使用纳米特定实体（即具有64Cu同位素的硼化卟啉复合物或含有GdIII复合物的含碳硼烷的胆固醇衍生物的脂质体）不满足BNCT的肿瘤摄取。这些结果表明需要进一步优化金纳米颗粒的形状和尺寸。此外，未来的方法将涉及组学技术，并结合允许开发所谓系统医学的计算工具。特别是，BNCT可以利用分子剖析的方法体系来提高对新化合物及其与中子照射结合的影响的理解。本文所描述的工作中最相关的方面是不断努力开发新的治疗药物，这可能有助于在BNCT领域取得突破。

作者贡献：W.A.G.S.：概念、编辑和最终写作；L.S.：第4节和第5.3节；E.H.-H.和M.K.：第5.1节和第5.3节；L.P.和D.I.： 第5.2节；M.B.：第3节和第5.3节；G. R.和E.S.：第2节和第3节；K. H.：第3节；P. M.和A.D.P.：第6节；A.W.：第1节和第7节。所有作者均已阅读并同意稿件的出版版本。

资金来源：E.H.-H.和M.K.感谢DFG的支持（HE 1376/38-1）；L.S. 获得了GEFLUC格勒诺布尔·多芬·萨沃伊的资助。

机构审查委员会声明：不适用。

知情同意书：不适用。

利益冲突：作者声明没有利益冲突。

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