原核生物表达异源蛋白--最佳分泌信号肽筛选策略--思路来自2018年的文献

枯草芽孢杆菌分泌生产异源蛋白的最佳信号肽的系统筛选

J. Agric. Food Chem. 2018, 66, 13141−13151

原始文献链接：

http://pubs.acs.org/action/showCitFormats?doi=10.1021/acs.jafc.8b04183

实验方法：

1. 构建信号肽库：

   • 以α-淀粉酶AmyS作为报告蛋白，构建了一个包含173个Sec型信号肽的库。
   • 使用快速、序列独立的多聚体PCR克隆方法，将信号肽融合到目标蛋白上，无需使用限制性内切酶或连接酶。
   • 通过PCR扩增从B. subtilis 168基因组中预测的173个Sec型信号肽编码片段，并将其克隆到pMA5-PaprE-amys表达载体中。

2. 细菌菌株和质粒：

   • 使用B. subtilis菌株1A751p作为表达宿主，该菌株过表达了PrsA折叠酶基因。
   • 使用标准DNA操作程序进行所有DNA操作。

3. 培养基、生长条件和培养上清液的准备：

   • E. coli在Luria−Bertani (LB)肉汤中培养，Bacillus subtilis在SR培养基中培养。
   • 通过离心收集培养上清液，用于测定α-淀粉酶活性。

4. Bacillus subtilis的转化：

   • 使用两步转化方法，将多聚体质粒DNA直接转化到B. subtilis中。

5. 高吞吐量筛选α-淀粉酶高分泌菌株：

   • 使用淀粉-碘基础的高通量方法筛选具有高分泌α-淀粉酶活性的构建体。
   • 通过观察琼脂板上的透明圈来验证α-淀粉酶活性。

6. 发酵和α-淀粉酶活性测定：

   • 使用7.5-L生物反应器进行规模发酵，采用连续补料策略。
   • 通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定α-淀粉酶活性。

7. SDS-PAGE分析：

   • 通过SDS-PAGE分析收集的培养上清液中的α-淀粉酶。
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实验结果：

1. 信号肽库的构建和筛选：

   • 通过高通量筛选，发现在173个信号肽中，有15个信号肽显著提高了AmyS的产量。

2. 信号肽性能与分泌效率的相关性分析：

   • 分析了最佳表现信号肽的序列属性与其分泌效率之间的相关性，发现没有直接的相关性。
   • 然而，与这些信号肽对应的mRNA结构的Gibbs自由能折叠值与分泌效率之间存在一定的相关性。

3. 发酵结果：

   • 在7.5-L发酵罐中，使用最佳信号肽pel的B. subtilis 1A751pSP4菌株，α-淀粉酶活性在60小时达到最大值5086 U/mL，产量为77.1 U/mL·h。
   • SDS-PAGE分析显示，分泌的α-淀粉酶大小约为60 kDa，与成熟AmyS蛋白的理论分子量一致。

4. 信号肽的N-、H-和C-结构域的序列对齐和标志序列分析：

   • 通过序列对齐和标志序列分析，发现了一些共同属性，如N-结构域中频繁出现的正电荷氨基酸赖氨酸，H-结构域中由亮氨酸组成的高度疏水区域，以及C-结构域末端的信号肽切割位点。

这些结果表明，通过构建和筛选信号肽库可以有效地提高目标蛋白的分泌效率，并且对于不同的目标蛋白，需要筛选和鉴定个体最优的信号肽。