​小鼠肝组织中淋巴细胞提取过程​

　　关于小鼠肝组织中淋巴细胞提取过程，有不明白的小伙伴可以一起来看看啦。针对实验过程以及用材，方法等既有相同点也有不同点，小伙伴们各自斟酌。

取前处理：眼球静脉注射conA

18小时后肝损伤最严重，准备取肝。

⑴摘眼球放血

⑵先用酒精将小鼠的腹部淋湿，再用剪刀剪开外皮，再用手撕开，拿镊子把肝取出

⑶把肝放入提前准备好的培养皿中，培养皿中有些1x PBS

⑷取一张未用过的大小合适的钢网，把肝放到钢网上并把钢网照到培养皿上，按紧，用针管塞研磨肝组织，直至研碎

⑸把研磨好的肝组织液转移到锥形离心管中，并用1x PBS冲洗残留组织。用1x PBS把所有的锥形离心管液体加到一个高度

⑹500转 离心1分钟后 取上清并把上清转入到新的锥形离心管中，转管时用钢网过滤

⑺2200转 离心10分钟后 弃去上清

⑻在离心期间配制梯度离心液：

90%的梯度离心液共20ml：18毫升原溶液+2毫升10x PBS

70%的梯度离心液共18ml：12.6毫升90%percoll溶液+5.4毫升1x PBS

40%的梯度离心液共18ml：7.2毫升90%percoll溶液+10.8毫升1x PBS

⑼把3毫升40%的梯度离心液，倒入到离心后的细胞中，混匀。取新的离心管，每个锥形离心管中先加入3毫升70%的梯度离心液，在把悬有细胞的40%的梯度离心液加入到盛有70%的梯度离心液的离心管中，注意第一枪要缓慢加入使它形成一个稳定的液面，两层液体体积比最好为3:3

⑽1260 G ,20度,升6,降2,离心30分钟后形成三个液面，红细胞会沉入最下层液面，中层有淋巴细胞，上层为厚厚的一层肝组织的其它细胞(应该为肝的实质细胞)

⑾越过上层界面吸取中层液体（中间为薄薄的一层白色淋巴细胞，吸取时会把上层40%液体吸入），大约有三毫升，把吸取的液体放到新的锥形离心管中并加入适量1xPBS冲洗，然后2200转 离心10分钟

⑿离心后弃去上清，向其中加入少许1x PBS（如200微升），吹打混匀，转入96孔圆底细胞培养板中

⒀2000转 离心5分钟，弃去上清 注意弃上层液体不要弃第二次，防止液体回流把细胞弃出

　　以下步骤在超净工作台中进行，用之前应进行准备工作紫外照射，通风，亮灯，75%的酒精擦拭桌面、微量移液器等。

⒁取15毫升RPMI—1640完全培养液（含有10%的胎牛血清即FBS），向其中加入PMA(1:1428)，Ion(1:1000)，Glogistop(1:1000)，IL-2（1:500）；其中PMA和Ion刺激淋巴细胞成倍分泌细胞因子，Glogistop抑制细胞因子向细胞外的分泌，便于后期检测，其较Glogiplug应用范围更广，作用相同，IL-2可刺激淋巴细胞的增殖；使它们混合均匀

⒂每孔加入200微升配好的培养液（共培养了12个孔），盖上盖子

⒃把细胞培养板放入到37度水泵式二氧化碳培养箱中培养

⒄6小时后，取出2000转 离心5分钟 弃上清

　　染色前准备：每孔应配成50微升的体系，表面染色用1xPBS配，12个孔共需600微升，其中每种抗体加入的比例为1：200即需要抗体，600 x 1/200=3微升，其余用1xPBS补满即可（也可取600微升1xPBS再加入3微升抗体，因比例较小可这样粗略计算）。胞内染色：表面染色结束后用200毫升1xPBS洗一遍，2000转 离心5分钟 弃上清；之后先用2%的甲醛（2g甲醛溶于100ml 1xPBS中，也可用37%-45%的甲醛溶液稀释得到）固定 避光30分钟，再进行打孔，用0.5%的saponin（0.5g  saponin溶于100ml 1xPBS中）打孔 避光30分钟；用INF-?抗体(也配成50微升的体系此次用saponin配)染色30分钟 避光

⒅细胞表面染色，此次用抗体NK1.1和抗体TCRβ（也可用抗体CD3）染色,4℃ 15分钟 避光；染好后加200微升1xPBS洗去未染上的抗体，2000转 离心5分钟 弃上清

⒆用2%的甲醛固定细胞 避光 30分钟，用0.5%的saponin打孔 ，避光30分钟；用量：在细胞培养板中固定、打孔各用200微升，若在流式管中固定、打孔各用2ml；用INF-?抗体染色30分钟 避光，染好后用200微升1xPBS冲洗，2000转 离心5分钟 弃上清；向孔中加入适量1xPBS吹打混匀，转入流式上机检测的管中，转好后加入适量1xPBS待测。