10X空间转录组 & 蛋白组联合分析之空间分区模式

hello，大家好，今天我们来继续分享关于10X空间转录组的分析内容，今天的内容重点是分区，当然了，空间的分区往往是人为划分的，但是我们要寻找到一种计算的方法，利用数学的手段辅助我们进行划区，从而进行更加深入的研究，好了，话不多说，开始我们的分享。

今天分享的文章是Spatial proteogenomics reveals distinct and evolutionarily-conserved hepatic macrophage niches,文中的空间分析方法很不错，推荐给大家，下面放几张效果图

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当然，我们重点要关注的就是空间分区模式，好了，开始正文部分。

Abstract

肝脏是身体中最大的实体器官，但它的特征仍然不完整。 在这里，文章展示了健康人和鼠肝脏的空间蛋白质基因组图谱，结合了单细胞 CITE-seq、单核测序、空间转录组学和空间蛋白质组学。 通过整合这些多组学数据集，提供了经过验证的策略来可靠地区分和定位所有肝细胞（也是我们关注的重点）。 然后文章在七个物种中对齐这个图谱，揭示真正的Kupffer细胞和胆管巨噬细胞的保守程序。 还揭示了这些巨噬细胞各自的空间分辨细胞壁龛和驱动它们独特转录组学特性的微环境回路。 分析证明胆管巨噬细胞是由局部脂质暴露诱导的，而Kupffer细胞主要依赖于它们通过进化保守的 ALK1-BMP9/10 轴与肝星状细胞的串扰。

Introduction

单细胞转录组学的巨大技术进步使人们能够更好地了解跨物种不同器官的细胞组成。然而，仍然缺乏关于这些细胞如何在其独特的微环境生态位中组织的信息。此外，决定组织内单个细胞身份的特定细胞间相互作用仍有待定义。虽然了解肝脏内肝细胞的空间组织，但非实质肝细胞的空间组织仍不清楚。这是小鼠肝脏的情况，但对于人类肝脏更是如此，其中大多数肝细胞的身份和精确定位是未知的。此外，转录组和蛋白质组之间的联系尚未得到研究，导致缺乏可靠的表面标记来通过流式细胞术和共聚焦显微镜识别、纯化或定位这些细胞。在这里，使用了包括 CITE-seq 和空间方法在内的蛋白质基因组学技术来识别小鼠和人类健康肝脏中的所有细胞及其特定位置。通过这样做，制定了识别和进一步研究不同细胞类型的策略。为了证明这种方法的有效性，利用这些信息，还确定了在健康肝脏中驱动不同肝脏巨噬细胞表型的保守空间相关信号（空间驱动信号，很好的角度）。

Results

A practical proteogenomic atlas of the murine liver

为了生成肝脏的蛋白质基因组图谱，examined the optimal method for retrieving all hepatic cells。 使用鼠肝脏，我们使用通过体外或体内酶消化分离的单细胞技术(scRNA-seq)与单核 RNA 测序 (snRNA-seq)。 对于每种技术，我们都观察到了不同的细胞组成。虽然，snRNA-seq 产生的基因/细胞数量低于 scRNA-seq，但它更好地概括了体内观察到的细胞频率。 鉴于每种方法的不同细胞组成，为确保所有细胞都可以进行分析，我们选择在我们的研究中使用所有protocols的组合。 为了在单细胞分辨率下研究 mRNA 和蛋白质表达，我们通过测序 (CITE-seq) 使用转录组和表观的细胞index。 因此，我们用 107-161 寡偶联抗体对选定的 scRNA-seq 样本进行染色（下图）

将数据汇集在一起进行单一分析，其中使用 TotalVI，将蛋白质和 mRNA 谱都考虑用于聚类（多组学分析，相当不错，有能力的课题组希望多多挖掘这方面的内容）。

差异表达基因 (DEG) 和蛋白质 (DEP) 的分析确定了 17 种细胞类型。 此外，我们确定了所有细胞的表面标志物，包括Kupffer细胞的 VSIG4 和 FOLR2。

Distinct spatial orientation of hepatic myeloid cell subsets（空间方向）

为了定位鉴定出的细胞，我们使用 Visium 进行了空间转录组学分析。 为此，我们以两个不同的方向切割肝脏，以描绘肝脏组织和被膜

• 注：Tissue and capsule images from Visium analysis with clusters overlaid

我们沿着空间轨迹对每个 Visium 点进行排序，并根据已知的肝细胞分区标记对入口、门静脉周围、中部和中央区域进行注释 （这个注释很精细）。

• 注：(D) UMAP of zonation of Visium spots (left) & origin of the cells (right). (E) Zonation pattern mapped onto tissue slice.

通过使用参考 sc/snRNA-seq 数据，我们然后将每个点解卷积为其组成细胞类型，并研究细胞丰度如何随分区变化

Validating this approach, as reported, cholangiocytes mapped specifically to the portal zones.而 KCs 位于portal周围和中间区域。 此外，我们在所有区域都发现了 T 细胞、内皮细胞 (EC) 和基质细胞 (SC)，而在门静脉中发现了常规树突状细胞 (cDC)，在中央静脉中发现了少量存在。

为了以单细胞分辨率验证这些位置，接下来试图确定也可以通过共聚焦显微镜工作的最佳细胞特异性表面标记。 由于用于共聚焦显微镜的固定步骤通常会影响不同表位的完整性，因此无法预测哪些在单细胞悬液上起作用的抗体将在固定和完整组织上起作用。 因此，为了同时筛选多种抗体以识别通过显微镜起作用的抗体，进行了第二次 Visium 分析，并补充了 100 种寡偶联抗体（Visium 高度多重蛋白），这些抗体是根据 CITE-seq 结果选择的

• 注：mRNA zonation pattern in Visium Highly-Multiplexed Protein analysis and VSIG4-ADT expression pattern (left) and zonated expression patterns of indicated antibodies (right).

The antibodies identified to work spatially were then validated at single-cell resolution, using MACSimaTM Imaging Cyclic Staining (MICS) technology and a 60-plex antibody panel

• 注：MICS analysis of indicated proteins and cell types

不幸的是，无法为所有populations识别有用的表面标记，例如，没有识别出足够的区分性表面标记，这些标记可以通过共聚焦显微镜在空间上区分 cDC 子集。 Thus, to confirm the locations of these cell subsets we turned to Molecular CartographyTM (Resolve BioSciences) that allows for 100-plex spatial mRNA analysis.基于来自 sc/snRNA-seq 数据的 DEG 选择基因，这些数据也根据 Visium 进行了空间解析。 还使用胆管细胞基因（Epcam、Spp1）和已知的分区肝细胞基因（Glul、Cyp2e1、Hal、Sds）确定了该数据集中的portal中心轨迹。 使用 Xcr1、Clec9a (cDC1s) 和 Cd209a、Mgl2 和 Clec10a (cDC2s) 的表达，我们证实 cDC1s 和 cDC2s 主要位于门静脉。

• 注：Molecular Cartography of indicated genes and cell types.

这些分析中 mRNA 表达的点状性质与髓样细胞的树突形状相结合，使得很难令人信服地确定细胞边界并得出结论，这些 cDC2 和巨噬细胞是不同的细胞。 为了验证这一点，因此开发了一种将 mRNA 检测 (RNAScope) 与表面蛋白检测相结合的protocol。 结合蛋白质表面标记检查 cDC 或巨噬细胞特异性 mRNA 的表达证实了门静脉 cDC1、cDC2 和非 KC 巨噬细胞的存在

• 注：mRNA (Xcr1, Flt3l, Mafb and Clec10a) and protein (MHCII and F4/80) expression in the same tissue slice. Scale bar 50μm. PV; portal vein, CV; central vein. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.

总之，通过结合多种空间转录组学和蛋白质组学方法，定位了小鼠肝脏内的所有细胞，并确定了骨髓细胞内的额外异质性，在单独检查 sc/sn-RNA-seq 数据集时没有发现。 这突出了结合单细胞和空间蛋白质基因组学技术来研究细胞异质性的力量。

骨髓细胞的精细分析确定了肝巨噬细胞的三个亚群

为了更好地了解这些非 KC 巨噬细胞，我们在定义 11 个群体的 sc/snRNA-seq 分析中放大了（再分群）骨髓细胞（cDC、KC、单核细胞和单核细胞衍生细胞） 。

• 注：(A) UMAP of murine myeloid cells (71261 cells/nuclei) isolated from Fig. 1B and re-clustered with TotalVI. (B,C) Top DEGs (B) and DEPs (C) between cell types identified.

This included KCs, 3 populations of non-KC macrophages and cells，其特征介于单核细胞和巡逻单核细胞或巨噬细胞之间，称为过渡单核细胞。 对非 KC 巨噬细胞的仔细检查发现 cluster6 为腹膜巨噬细胞。其余类群之间的 DEG 表明 cluster7 可能类似于胶囊巨噬细胞，表达 Cd207 和 Cx3cr1，而 cluster8 类似于我们最近在脂肪肝中描述的 Gpnmb+Spp1+ 脂质相关巨噬细胞 (LAM) 允许将 CITE-seq 数据转换为流式细胞仪文件待定义的硅内门控策略。验证这一点，利用该策略来纯化类群并评估基因表达。在消化前清洗肝脏可以使清洗部分中的腹膜巨噬细胞富集，表明这些是肝脏表面的污染物，而不是存在于肝脏组织本身中。虽然 CITE-seq 标记不能区分cluster 7 和 8，但将 CD207 添加到panel中可以将非 KCs 分为 CD207+ 和 CD207- 巨噬细胞。与它们被称为capsule巨噬细胞的名称相吻合，如果我们解剖和消化capsule，CD207+ 巨噬细胞的相对丰度就会增加。然而，尽管分子图谱证实了capsule中存在 Cd207+ 巨噬细胞，但它也揭示了中央静脉的 Cd207+ 巨噬细胞，而门静脉很少发现这种巨噬细胞。

• 注：(E) Expression of VSIG4 and F4/80 (left) or MHCII, CD11c and DAPI (right) by confocal microscopy. Capsule macrophages (left) or MHCII+ capsule macrophages (right) identified by white arrows. Scale bar 50μm. (F) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at liver capsule. (G) Expression of VSIG4, F4/80, GLUL and DAPI (left) or F4/80 or CCR2 (right, inset) by confocal microscopy. Scale bar 100μm. (H) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at portal triad. PV; portal vein, CV; central vein, HA; hepatic artery and BD; bile duct. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.

因此，cluster7 由capsule 和中央静脉 CD207+ 巨噬细胞组成。 这一发现进一步证明需要空间方法来确认细胞身份，因为这种特征以前被认为是capsule 巨噬细胞群所独有的。 分子图谱还在门静脉和中央静脉中鉴定出表达 Ccr2 和 Chil3 的巨噬细胞，类似于过渡单核细胞（cluster11）。 最后，发现一群表达 Gpnmb 的巨噬细胞专门位于胆管周围。 由于 Gpnmb 表达是 cluster8 特异性的，并且这些细胞类似于 LAM，我们将这些细胞称为胆管 LAM。

Macrophage subsets reside in distinct spatial niches(这也是空间的分析价值)

由于所有巨噬细胞群都与其局部环境中的 CD45- 细胞密切接触，我们进一步分析了 CD45-细胞，确定了多个 EC 和 SC 亚群，并采用了gating strategy来区分它们。

• 注：(A) UMAP of murine CD45- cells (83410 cells/nuclei) isolated from Fig. 1B and re-clustered with TotalVI. (B,C) Top DEGs (B) and DEPs (C) between cell types identified。

EC 可以进一步细分为 4 个不同的cluster，对其位置的分析使它们能够被识别为中央静脉 EC（cluster 10）、LSEC（cluster 9）、门静脉 EC（cluster 11）和淋巴 EC（LEC；cluster 12） 。

• 注;Molecular Cartography of indicated genes and cell types at central vein (left) and 2 different portal triads (center and right).

由于 Visium 在门静脉和中央静脉都发现了成纤维细胞，并且正如之前的一份报告表明这些细胞中存在不同的亚群，我们进一步放大了(再分群) SCs 以更好地评估它们的异质性

• 注：(F) UMAP of murine stromal cells (5430 cells/nuclei) isolated from the UMAP in Fig. 3A and reclustered with scVI. (G) Top DEGs between different cell types identified.

这揭示了仅限于capsule的间皮细胞和成纤维细胞的亚群。Myh11+ 血管平滑肌细胞 (VSMC) 位于肝动脉、门静脉和中央静脉周围，发现 Mfap4+Svep1+Clic5-Reln-成纤维细胞是中央静脉成纤维细胞。 最后，确定了位于胆管细胞周围的 Clic5+Reln+ 成纤维细胞 (cluster3) 的一个子集，我们将其称为胆管成纤维细胞。 总之，这些空间上不同的 ECs 和 SCs 子集的存在突出了不同巨噬细胞cluster所在的特定微环境的独特性。

健康人肝脏的实用蛋白质组学图谱

为了确定巨噬细胞亚群与小鼠和人类肝脏之间不同微环境生态位之间的保守程度，我们接下来使用 sc/snRNA-seq 和 CITE-seq 对 19 次肝脏活检生成了人类肝脏的蛋白质基因组图谱

• 注：(A) Cells or nuclei were isolated from liver biopsies (~1-2mm3; 14 cells, 5 nuclei) from patients undergoing either liver resection, cholecystectomy or gastric bypass. Live cells/intact nuclei were purified using FACS. Either total live, live CD45+, live CD45- or lineage-cells (live CD45+,CD3-, CD19-) were sorted. 7 cell samples were stained with a panel of 198 barcode-labelled antibodies for CITE-seq analysis. All datasets were pooled together and after QC 167598 cells/nuclei were analyzed using TotalVI. (B) UMAP of sc/snRNA-seq data.

其中，大多数在组织学上是健康的，只有 5 名患者表现出>10% 的肝脂肪变性。 细胞比例因所使用的isolation technique而异，虽然患者之间存在一些差异，但这与手术无关。 由于 Visium 可靠地定位了鼠肝细胞，我们使用它在 4 次活检中定位了人肝细胞

• 注：(C) UMAP of Visium data from 4 patient biopsy samples.

As patients with >10% steatosis clustered separately from the healthy samples

• 注：(E) Healthy and steatotic Visium liver tissue with clusters overlaid and H+E staining to identify steatotic zones.

我们使用健康样本来计算基线分区，然后将此轨迹转移到脂肪样本上

• 注：Zonation of Visium data (top) with zonation pattern mapped onto liver tissue (bottom).

这确定了这些患者的脂肪变性主要位于中心周围

• 注：Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto Visium zonation trajectory, healthy (top), steatotic (bottom).

这与之前的临床研究相吻合，该研究表明中央周围脂肪变性在 NAFLD 患者中最常见，尤其是在门静脉周围区域经常幸免的早期疾病中。 值得注意的是，尽管中性粒细胞优先位于脂肪变性区，但整体细胞分布不受中央周围脂肪变性的影响

An evolutionarily-conserved program of KCs

迄今为止，还没有描述真正的人类 KCs 的经过验证的标记。 在解释准确定义人类 KCs 的困难时，发现单核细胞和巨噬细胞在人类 sc/snRNA-seq 数据中形成了一个单一的连续体，阻止了人类 KCs 的简单定义。 为了进一步研究潜在的人类肝脏巨噬细胞异质性，我们放大了（再分群）骨髓细胞，确定了 10 个cluster。

为了定义 KC，接下来检查了这些cluster的前 25 个鼠 KC 基因的表达，这些cluster确定了 cluster10 是真正的人类 KC。 与小鼠不同，它们优先位于中间区域。 Cluster9 也表达了许多这些基因，但缺乏 TIMD4，这表明这些细胞可能是最近招募的单核细胞衍生的 KCs (moKCs)。 尽管单独的 VSIG4 表达并不能准确识别人类肝脏中的 KC，但在 CITE-seq 数据中发现 VSIG4 蛋白是人类 KC 的最佳标志物，这突出了检查表面蛋白质组和转录组的重要性。

• 注：Expression of VSIG4 protein (top) and CD5L mRNA (bottom).

这通过流式细胞术和对人肝脏的 VSIG4 和 KC 特异性基因 CD5L 的共染色进行了验证，这也证实了它们的mid-zonal localization

• 注：Expression of VSIG4, F4/80, FOLRB, GLUL combined with Cd5l/CD5L on murine (left) and human (H25; right) livers. Scale bar 50μm. Inset in bottom panels. Scale bar 20μm. Images are representative of 2-4 mice/patients.

为了评估 KC 身份在进化过程中是否进一步保守，我们分析了猕猴、猪、仓鼠、鸡和斑马鱼的肝脏

通过将保守的人-鼠 KC signature映射到数据集上，以无偏见的方式识别了 KC。 然后检查了确定的每个 KC 群体的主要特征。 观察到跨物种转录组的强烈重叠可能是由于核心 KC 转录因子的保守表达。 VSIG4 蛋白表达在猪和猕猴 KCs 中也是保守的。 同样，还能够根据保守基因识别跨物种的大多数其他肝细胞。 cDC2s 是主要的例外，因为特定的 cDC2 标记基因并非在所有物种中都是保守的。

LAM 位置在脂肪变性人肝脏中发生改变

除了 KCs，我们还在肝囊中发现了人类 CD68+VSIG4-巨噬细胞，靠近中央静脉和门静脉以及胆管。在健康猕猴肝脏的门静脉和中央静脉以及胆管中也观察到了类似的种群。 检查 scRNA-seq 数据并与小鼠特征进行比较，确定了未成熟和成熟的 LAM，从而能够定义保守的 LAM 特征。 尽管最近的一项研究表明这些细胞对纤维化肝脏具有特异性，但我们在所有使用 scRNA-seq 分析的患者中都发现了 LAM，但在 2 个脂肪变性 >10% 的肝脏中，LAM 的比例有增加的趋势。 与显微镜和鼠胆管 LAM 一致，人类 LAM 位于非脂肪肝的汇管区。 然而，在脂肪变性的人类肝脏中，LAMs 主要位于中央周围，与脂肪变性相关

• 注 ：Human LAM signature from scRNA-seq mapped onto the Visium zonation data, healthy (purple), steatotic (orange).

在喂食西方饮食 (WD) 36 周以诱发脂肪肝疾病后，在小鼠中使用 Visium 也验证了 LAM 位置的这种变化。 在这里，与整个肝脏存在脂肪变性相吻合，在门静脉、门静脉周围和中间区域发现了 LAM。 鉴于两种物种中 LAM 的位置与过量脂质的存在以及发现 LAM 的不同位置之间的生态位细胞的异质性相关

• 注：(F) UMAP of human CD45- cells (15481 cells/nuclei) isolated from Fig. 4B and re-clustered with scVI. (G) Top DEGs between cell types identified. (H) Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto the Visium zonation data, healthy (top), steatotic (bottom).

this suggests that LAM phenotype and abundance may be regulated by lipid exposure rather than by specific local cell-cell interactions conserved at the two locations.

Differential NicheNet analysis across species reveals a crucial role for the ALK1-BMP9/10 axis in KCs.（空间通讯分析）

为了评估保守的细胞 - 细胞相互作用与局部代谢物（如脂质）在驱动跨物种巨噬细胞异质性方面的作用，我们在不同的肝巨噬细胞和存在于各自壁龛中的 CD45-细胞之间进行了差异 NicheNet 分析，重点是配体和在人和小鼠中都保守的受体。 与 KCs 相比，这揭示了 LAMs 的特定配体 - 受体对非常少，进一步暗示驱动 LAM 表型的主要信号可能不是来自独特的细胞 - 细胞相互作用。

• 注：Differential NicheNet highlighting prioritized conserved (human-mouse) ligand-receptor (LR) pairs between indicated macrophages and their niche cells. LR pairs are grouped according to the niche cell type with highest ligand expression

与此一致，用乙酰化低密度脂蛋白培养的 BM 单核细胞表达 LAM 相关基因，表明脂质在诱导 LAM 表型中起主导作用。

• 注：Mouse BM monocytes were cultured in the presence of CSF1 and indicated concentrations of ac-LDL, prior to being purified and analyzed for expression of indicated genes by qPCR. Data are pooled from 2 experiments. One-Way ANOVA with Bonferroni post-test compared with 0ng/ml

对形成 KC 生态位蓝图的细胞串扰的进一步研究发现，人类和小鼠之间存在多个配体 - 受体对

• 注：NicheNet circos plot highlighting conserved ligand-receptor pairs and induced target genes between KCs and indicated niche cells in human and mouse

其中之一，KCs（ALK1；由 Acvrl1 编码）和星状细胞（分别由 Gdf2/Bmp10 编码的 BMP9/10）之间的 ALK1-BMP9/10 回路被发现在所有 7 个物种中都是保守的，并被预测控制表达 许多保守的 KC 转录因子（图 6C、D 和 S7E、F）。 为了验证这个轴，我们生成了 Fcgr1-Cre x Acvrl1fl/fl 小鼠，从巨噬细胞中消除了 ALK1。 这导致 VSIG4+ KCs 几乎完全丧失，表明进化上保守的 ALK1-BMP9/10 轴对于肝脏中 KC 的存在至关重要。

Discussion

为了生成任何人体组织的实用细胞图谱并解开对居住在该组织中的细胞的身份至关重要的细胞-细胞回路，需要四个关键信息：（i）存在的所有细胞的list，（ii）位置组织内不同细胞之间的相互作用，以识别相邻细胞之间的相互作用，(iii) 人类和动物模型之间的比对，允许任何预测的细胞 - 细胞相互作用受到干扰，以及 (iv) 识别可靠的基于抗体的面板 有效筛选不同患者和/或转基因动物。 在这里，通过整合单细胞和空间转录组学和蛋白质组学数据，我们为肝脏提供了这 4 条信息，并揭示了控制肝脏巨噬细胞发育的进化保守的微环境回路。

强调需要结合不同的分离策略来正确分析所有肝细胞，我们证明如果没有 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的组合，肝脏图谱中将缺乏不同的人和鼠基质细胞亚群。解开所有肝细胞的空间定位，我们确定了健康小鼠、人类和猕猴肝脏胆管周围的 LAM。然而，当存在脂肪变性时，LAMs 会扩张并定位到脂肪变性的周围区域，这让人想起 LAMs 在肥胖小鼠肝脏中的扩张。这种空间信息至少部分否定了 LAM 身份是由纤维化基质细胞特异性诱导的假设，并支持 LAM 主要由局部脂质暴露诱导的概念，正如我们在实验中所证明的那样。尽管脂质的确切来源仍有待确定。我们还提供了七个物种的肝脏图谱的比对。这揭示了稳态 KCs 的保守转录组程序，并揭示了 KCs 与构成其生态位的细胞之间空间受限和保守的配体-受体对。强调在试图了解疾病如何扰乱细胞之前首先表征健康组织的必要性，我们将 DLL-NOTCH 相互作用确定为稳态 LSEC 和 KC 之间进化保守的串扰，因此并非肝细胞癌或纤维化所独有，正如最近提出的那样。同样，我们发现 FOLR2 表达不是肿瘤相关肝巨噬细胞所特有的，而是在健康小鼠和人类肝脏的 KCs 上表达（mRNA 和蛋白质）。最后，我们从广泛的寡偶联抗体面板开始应用蛋白质基因组学管道，用于单细胞和空间分析。这是至关重要的，因为转录组分析并不总是与通过流式细胞术或显微镜检测蛋白质的能力相对应。通过广泛筛选，我们确定了分离和定位肝巨噬细胞及其各自生态位细胞的最佳表面标志物。这既可以验证单细胞水平的空间位置，也可以有效筛选转基因小鼠模型的 KCs 损失。使用我们定义的面板对 Fcgr1-CrexAcvrl1fl/fl 小鼠的表征很容易证明 ALK1-BMP9/10 轴在 KCs 中的重要性，强调巨噬细胞-成纤维细胞的串扰比生长因子的交换更进一步。展望未来，将这些相对便宜的抗体组应用于大型患者队列或多个转基因小鼠模型，应该能够有效识别任何扰乱肝脏稳态的扰动。

Method

Modelling of Visium data（数学的内容还是很难）

解卷积

空间通讯分析

生活很好，有你更好