DNA pull-down 要点

一、原理概述

 

DNA pull-down是体外研究DNA与蛋白互作的有力工具。该技术将生物素标记的DNA片段结合在链霉亲和素磁珠上，再与细胞核蛋白孵育，纯化出与DNA片段互作的蛋白，洗涤洗脱得到的蛋白产物，做western-blot检测特定蛋白是否与靶DNA片段结合；做质谱鉴定即可筛选出与DNA片段可能互作的蛋白信息（如具体某个或某些转录因子/组蛋白等）。

 

生物素与链霉亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用；其中活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联。因此用生物素标记核酸后，可以纯化出与该核酸结合的各种生物大分子复合物。

 

 

二、实验流程

 

 

DNA pull-down实验首先针对靶标区域设计特异性DNA探针，探针经过脱硫生物素标记，跟偶联在磁珠上的链霉亲和素结合；细胞核提取物与磁珠-DNA探针孵育，作用蛋白质分子可以和DNA探针特异性结合；纯化出与靶DNA片段结合的蛋白复合体，经过洗涤可以将非特异性结合蛋白质去除；最后，经洗脱液洗脱，得到目的DNA探针-蛋白质复合物，再经过Western Blot或质谱（MS）鉴定蛋白质类型。

 

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