mNGS(宏基因组)_分析流程

conda activate mNGS

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1.测序文件准备

J35_NDME10119_1.clean.fq
J35_NDME10119_2.clean.fq # 双端测序数据一个样本对应两个数据文件，用1.fq.gz和_2.fq.gz进行区分

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2.测序数据质控

fastqc /mnt/d/mNGS/input/J35_NDME10119_1.clean.fq /mnt/d/mNGS/input/J35_NDME10119_2.clean.fq -o /mnt/d/mNGS/output/01_质控/

质控结果文件解读:

1. read各个位置的碱基质量值分布：所有read数据综合起来一起分析的。
2. 碱基的总体质量值分布：对于二代测序，达到Q20的碱基要在95%以上（最差不低于90%），Q30要大于85%（最差不要低于80%）。
3. read各个位置上碱基分布比例：A和T比例应该差不多，C和G的比例也应该差不多。
4. GC含量分布：基因组GC含量一般40%左右，如果GC含量的图谱明显偏离这个值，说明测序过程存在较高的序列偏向性，结果不准确，影响后续分析。
5. read各位置的N含量：N在测序数据中一般是不应该出现的，如果出现则意味着，测序的光学信号无法被清晰分辨，如果这种情况多的话，往往意味着测序系统或者测序试剂的错误。
6. read测序是否测到了接头序列：一般的WGS测序是不会测到这些接头序列的，因为构建WGS测序的文库序列（插入片段）都比较长，约几百bp，而read的测序长度都在100bp-150bp。不过在进行一些RNA测序的时候，它们的文库序列本来就比较短，很多只有几十bp，很容易出现read测通的现象，即read末尾包含了接头序列。
7. read重复率，这个是实验的扩增过程所引入的。

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3.切除测序接头序列和测序低质量序列

1. Trimmomatic（java程序）
2. 可以用来切除illumina测序平台的接头序列，还可以去除由我们自己指定的特定接头序列，而且同时也能够过滤read末尾的低质量序列。
3. 具体的原理就是通过滑动一定长度的窗口，计算窗口内的碱基平均质量，如果过低，就直接把此处往后的序列全部切除。
4. 如果下机的fq数据中不含有测序接头序列，也可以使用trimmomatic.
5. 包里面有一个adapters文件夹，默认存放的是illumina测序平台的接头序列（fasta格式），也可以自定义。

HiSeq PE测序

Trimmomatic PE -phred33 -threads 8 \  # 默认是Phred64，但我们现在的测序数据基本都是用的Phred33
-trimlog logfile \
reads_1.fq.gz \  # 输入文件,可以用-basein和-baseout指定，也可以不用
reads_2.fq.gz \  # 输入文件
out.read_1.fq.gz \  # 输出文件
out.trim.read_1.fq.gz \  # 被过滤掉的read信息
out.read_2.fq.gz \  # 输出文件
out.trim.read_2.fq.gz \  # 被过滤掉的read信息
ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
SLIDINGWINDOW:5:20 \
LEADING:5 \
TRAILING:5 MINLEN:50

HiSeq SE测序

Trimmomatic SE -phred33 -threads 8 \
-trimlog se.logfile \
untreated.fq.gz \
out.untreated.fq.gz \
# 不需要指定文件来存放被过滤掉的read信息
ILLUMINACLIP:TruSeq3-SE.fa:2:30:10 \
SLIDINGWINDOW:5:20 \
LEADING:5 \
TRAILING:5 \
MINLEN:50

LLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10：
TruSeq3-PE.fa 是接头序列；2是比对时接头序列时所允许的最大错误数；
30指的是要求PE的两条read同时和PE的adapter序列比对，匹配度加起来超30%，那么就认为这对PE的read含有adapter，并在对应的位置需要进行切除【注】。
10和前面的30不同，它指的是，我就什么也不管，反正只要这条read的某部分和adpater序列有超过10%的匹配率，那么就代表含有adapter(接头)了，需要进行去除。
【注】测序的时候往往只会在测到一些部分的adapter，因此read和adaper的时候肯定是不需要要求百分百匹配率的，上述30%和10%其实是比较推荐的值。

SLIDINGWINDOW:5:20 窗口长度为5，窗口中的平均质量值至少为20，否则会开始切除。
LEADING 规定read开头的碱基是否要被切除的质量阈值。
TRAILING 规定read末尾的碱基是否要被切除的质量阈值。
MINLEN 规定read被切除后至少需要保留的长度，如果低于该长度，会被丢掉。

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4.可以再质控一下，与之前的结果进行比较

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