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概述
共聚焦显微镜是一种利用逐点照明和空间针孔调制来去除样品非焦点平面的散射光的光学成像手段，相比于传统成像方法可以提高光学分辨率和视觉对比度。共聚焦显微镜可以提供高精度的三维成像数据，以及准确的亚细胞结构和动态成像，广泛应用于生物医学研究和材料科学应用中。
基本原理
从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观察物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦。在反射光的光路上加上了一块二向色镜，将已经通过透镜的反射光折向其他方向，在其焦点上有一个带有“针孔”（Pinhole），小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）。探测光焦点前后的反射光通过这一套共聚焦系统，不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。
激光共聚焦显微镜工作过程示意图
使用共聚焦显微镜获取的图像
共聚焦显微镜和标准宽视野显微镜的图像比较
用共聚焦显微镜采集的三维图像实例
共聚焦显微镜和标准宽视野显微镜的区别
要测量荧光，就要向样品发射激发光，在共聚焦显微镜中，主要用激光光束作为激发光源。激光光束是具有良好直线性能的点光源，其焦点是通过物镜在焦平面形成的光斑。
物镜放大率、NA 和激发波长的组合方式决定了可以聚焦的最小光斑大小。 NA 越高且波长越短，光斑尺寸就越小，分辨率也越高。
宽视野荧光显微镜一次激发整个样品区域；共聚焦显微镜一次仅激发焦点平面上的一个点。
激光光束聚焦在焦平面上
为了观察光路，在物镜上方放置一块荧光材料，当来自物镜的激发光穿过荧光材料块时，光路中的荧光材料就会向各个方向发射荧光，通过观察荧光来跟踪激发光的路径。
常规宽视野显微镜激发光会分散在整个样品上；共聚焦显微镜光束在焦点平面形成一个光斑。
激光器激发光与标准宽视野显微镜激发光的图像比较
荧光块中焦点平面的上方和下方在发射荧光，称为失焦荧光。这种失焦荧光也出现在真实样品中，是导致图像模糊的原因。在共聚焦显微镜中，发射到焦点平面外的荧光受阻，因而不会到达探测器。这样就可以仅使用焦点平面的光来生成图像。
激光光束收敛，然后向焦平面外发散
通过针孔去除失焦光
物镜焦点平面产生的荧光从物镜穿过成像透镜并在探测器上形成聚焦图像。将针孔放置在该位置。
在这种共聚焦光学场景中，通常将以下三个物体放置在接合点：
- 光源（更准确地说，是光源点）
- 物镜的焦点平面
- 探测器前面的针孔
若三者构成共轭位置关系，则其中任何一个点发出的光都将聚焦在另外两个点上。1发射的光会同时聚焦于2和3。3点发射的光会同时聚焦于1和 2，反之亦然。
检测从焦点平面发射的荧光
失焦光源发射的荧光在光路中传播如下面两图所示。焦平面上方或下方发射的荧光聚焦在针孔的底部，在很大程度上被阻挡，无法到达探测器。只有从焦点平面发射的荧光可以到达探测器。
消除发射到焦点平面外的荧光的技术
苏州微清眼底照相机产品介绍
激发光在光路中存在荧光材料的任何位置都能产生荧光。然而，通过仅选择从共轭位置发射到针孔中的荧光，可以获得仅源自焦点的图像。这称为光学切片图像。共聚焦显微镜的主要优点是能够从厚样品中获得该光学切片。
通过光学扫描获得二维图像
在实际操作中，会采用光学扫描装置在二维（x,y）方向移动光斑，以产生单个共聚焦荧光图像。
MEMS 振镜的移动和激发光斑的移动。
激发光斑对焦点平面进行平面扫描
与宽视野激发相比，扫描激发点邻近的荧光分子不被激发，并且不太可能产生杂散荧光。
PMT信号和图像组成
PMT（光电倍增管）是光电检测器，根据入射到受光表面上的荧光量随时间输出电信号，但没有位置信息。同时，光学扫描装置在 XY 方向上扫描固定位置达到固定的时间。
从而PM的信号输出会在任意给定时间从信号位置重构。也就是说，信号强度的时间信息被转换成空间信息，并且通过将辉度信息分配给图像的 XY 位置来生成图像。
PMT的信号输出随时间转换为二维图像
三维图像的测量方法
过垂直移动物镜，样品上的焦点位置也会垂直移动。因此，共聚焦图像位置也随着焦点的垂直移动而变化。通过获取的各个高度位置产生的各个共聚焦图像进行三维重构，可以构建三维图像。
聚焦的激光光斑随物镜的垂直移动而移动，采集图像相应改变
分类
商业化的共聚焦显微镜分三类：
- 共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM，LSCM）
- 转盘共聚焦显微镜（Spinning-disk (Nipkow disk) confocal microscopes）
- 可编程阵列显微镜（Programmable Array Microscopes (PAM)）
不同类型的共聚焦显微镜有不同的优缺点和适用范围。
共聚焦激光扫描显微镜
激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）是一种利用激光和针孔来实现高分辨率和高对比度的荧光显微镜¹。LSCM的基本原理是：
- 在LSCM中，激光光源经过一个扫描装置，使得激光束可以在样品上逐点扫描，形成一个小的激发焦点。
- 从样品发出的荧光信号经过一个针孔，使得只有来自焦平面的荧光信号能够通过，而来自非焦平面的散射光被阻挡。
- 通过这样的共聚焦配置，可以消除非焦平面的散射光，提高图像的分辨率和对比度。同时，可以通过改变焦平面的位置，对样品进行多层切片，形成三维重建图像。
LSCM的优点有：
- LSCM可以实现超过衍射极限的分辨率，达到200nm以下的水平分辨率和500nm以下的垂直分辨率。
- LSCM可以实现高灵敏度和高信噪比的荧光检测，因为它使用了单点照明和单点探测的方式，减少了背景噪声。
- LSCM可以实现多色、三维和动态成像，适用于各种生物医学研究领域。
LSCM的缺点有：
- LSCM需要使用高功率的激光光源，增加了系统的复杂性和成本，也可能导致样品的光损伤或光漂白。
- LSCM由于使用了针孔来阻挡非焦平面的散射光，也同时阻挡了部分焦平面的荧光信号，导致了光效率的降低和曝光时间的延长。
- LSCM由于使用了逐点扫描的方式，也可能引入了扫描噪声或者运动模糊等伪影，需要通过后处理算法来消除或减少。
转盘共聚焦显微镜
共聚焦转盘显微镜（CSD）是一种共聚焦显微镜的变种，它使用一个带有多个针孔或狭缝的旋转盘来实现对样品的快速扫描和光学切片。CSD显微镜的基本原理是：
- 在CSD显微镜中，激光光源经过一个带有微透镜的第一转盘，使得每个微透镜都能形成一个小光斑。
- 这些小光斑通过一个带有针孔或狭缝的第二转盘，使得每个针孔或狭缝都能形成一个激发焦点。
- 当两个转盘同步旋转时，这些激发焦点会在样品上扫描一个圆形区域，形成结构化的照明图案。
- 从样品发出的荧光信号经过第二转盘的针孔或狭缝，排除了非焦平面的散射光，然后被成像到相机上，形成一幅共聚焦图像。
CSD显微镜的优点有：
- 相比于激光扫描共聚焦显微镜（LSCM），CSD显微镜可以实现更高的成像速度和更低的光损伤，因为它使用了多个并行的激发焦点而不是单个的扫描焦点。
- 相比于宽场荧光显微镜（WF），CSD显微镜可以实现更高的分辨率和对比度，因为它使用了针孔或狭缝来消除非焦平面的散射光。
- CSD显微镜可以实现多色、三维和动态成像，适用于各种生物医学研究领域。
CSD显微镜的缺点有：
- CSD显微镜需要使用特殊的转盘和同步控制器，增加了系统的复杂性和成本。
- CSD显微镜由于使用了针孔或狭缝来阻挡非焦平面的散射光，也同时阻挡了部分焦平面的荧光信号，导致了光效率的降低和信噪比的下降。
- CSD显微镜由于使用了结构化的照明图案，也可能引入了条纹噪声或者亚像素偏移等伪影，需要通过后处理算法来消除或减少。
可编程阵列显微镜
可编程阵列显微镜（PAM）是一种利用空间光调制器（SLM）来实现灵活的光学切片和图像重建的显微镜¹。PAM的基本原理是：
- 在PAM中，SLM被放置在显微镜的第一成像平面上，可以用来控制样品的照明和/或探测模式。
- SLM可以产生任意形状和大小的光学孔径，用来定义激发焦点阵列或者荧光检测区域。
- SLM可以根据不同的样品或实验需求，选择最佳的切片方法，如结构化照明、图像扫描、多光子激发等。
- 通过对SLM产生的数据进行数学处理，可以重建出高分辨率和高对比度的图像。
PAM的优点有：
- PAM可以实现多种光学切片技术的集成和切换，提高了系统的灵活性和通用性。
- PAM可以实现高效率和高灵敏度的荧光检测，因为它使用了自适应的光学策略，减少了光损伤和背景噪声。
- PAM可以实现多色、三维和动态成像，适用于各种生物医学研究领域。
PAM的缺点有：
- PAM需要使用特殊的SLM和同步控制器，增加了系统的复杂性和成本。
- PAM需要对SLM产生的数据进行复杂的数学处理，增加了数据处理和存储的负担。
- PAM需要考虑SLM的分辨率和响应速度，以及荧光信号的线性性和饱和度。
参考资料
- 共聚焦显微镜 | 产品 | 徕卡显微系统
- 共聚焦显微镜 - 维基百科，自由的百科全书
- 共聚焦显微镜原理 | MEMS 共聚焦装置 | 滨松光子学株式会社
- 共聚焦显微技术 - 百度百科
- （双光子、共聚焦）荧光显微镜和普通显微镜的区别 - 分析行业新闻
- 荧光和共聚焦显微镜原理基础_哔哩哔哩_bilibili
- 共聚焦和传统显微镜有什么区别？共聚焦有什么劣势呢？ - 知乎
- What Is Spinning Disk Confocal Microscopy? - Teledyne Photometrics
- Confocal microscopy - Wikipedia
- Programmable Array Microscopes | Microscopy Today | Cambridge Core
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