共焦显微镜技术原理、参数及其应用

一、共焦显微镜技术原理

共焦显微镜是20世纪80年代出现并发展起来的高精度成像仪器，是研究亚微米结构必备的科研仪器。随着计算机、图像处理软件以及激光器的发展，共焦显微镜也随之发生了很大的发展，现已广泛应用于生物学、微系统和材料测量领域中。共焦显微镜是集共焦原理、扫描技术和计算机图形处理技术于一体的新型显微镜，其主要优点为：既有高的横向分辨率，又有高的轴向分辨率，同时能有效抑制杂散光，具有高的对比度。

典型的共焦显微镜装置是在被测对象焦平面的共轭面上放置两个小孔，其中一个放在光源前面，另一个放在探测器前面，如图1所示。由图可知，当被测样品处于准焦平面时，探测端收集到的光强最大；当被测样品处于离焦位置时，探测端的光斑发生弥散，光强迅速减小。因此，只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射针孔，而焦平面以外的点所发出的光线在出射针孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的针孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，两针孔共焦，共焦点为被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。

图1 共焦显微镜光路示意图

共焦显微镜中探测器处的针孔大小起着关键性的作用。它直接影响了系统的分辨率和信噪比。如针孔过大，则起不到共焦点探测作用，既降低了系统的分辨率，又会引入更多的杂散光；如果针孔过小，则会降低探测效率，同时降低显微图像的亮度。研究表明，当针孔直径等于艾里斑的直径时满足共焦要求，且探测效率也没有明显降低。由于针孔直径一般为微米量级，如果激光束的会聚焦点与针孔位置存在偏差，则会产生信号失真。因此，共焦显微镜一般均采用自动对焦系统，这无形中会增加测量时间。

由于激光共焦扫描显微镜是点成像，因此要想获得物体的二维图像，需要借助于x和y方向的二维扫描。不同的显微镜采用不同的扫描方式：

(1) 物体扫描。即物体本身按照一定的规律移动，而光束保持不变。优点：光路稳定；缺点：需要大幅度的扫描工作台，因此扫描速度受到很大限制。

(2) 利用反射式振镜构成光束扫描系统。即通过控制扫描振镜将聚焦光点有规律地反射到物体某一层面，完成二维扫描。其优点是精度较高，常用于高精度测量。扫描速度比物体扫描有所提高，但仍然不快。

(3) 使用声光偏转元件进行扫描，通过改变声波输出频率进而改变光波的传输方向来实现扫描。其突出优点是扫描速度非常快，由美国研制的利用声光偏转器产生实时视频图像的扫描系统，扫描一幅二维图像仅需1/30s，几乎做到了实时输出。

(4) Nipkow盘扫描，其扫描过程是通过旋转Nipkow盘而保持其他元件不动完成的，可以一次成像，速度非常快。但是由于成像光束是轴外光，所以必须对透镜的轴外像差进行校正，并且光能利用率很低。

二、共焦显微镜技术参数

2.1 分辨率

共聚焦显微镜的系统点扩散函数分布等于物镜和点像能量分布的卷积。在物镜相同的情况下，其横向分辨率(x-y面)比传统光学显微镜提高了1.4倍，达到0.4λ/NA，如Leica公司的TcS-NT分辨率为0.18μm。从共焦显微镜的原理可知，探测器处针孔的设置不仅有效抑制了离焦面点像对检测平面像的干扰，同时抑制了准焦面上非探测点对探测点的干扰，极大地改善了图像的分辨率。此外，为了实现极限分辨率，共焦显微镜系统必须配备防振工作台。

2.2 灵敏度

传统光学显微镜上常配备CCD相机来采集图像，但由于CCD的灵敏度比较低，对于低照度的光，如荧光无法探测到，因此在共焦显微镜系统中一般使用光电倍增管作为探测元件，其灵敏度大大超过CCD，对微弱的荧光信号也可以呈现出很高的灵敏度。

2.3 横向分辨率

共焦显微镜系统所展现的放大图像细节要高于常规的光学显微镜。此处所说的放大不是指物理上的放大，而是指在相同物镜放大的条件下，共焦显微镜所展示的图像形态细节是在传统光学显微镜下很难看到的，因而图像更清晰更微细，横向分辨率更高。

2.4 对比度

由于物体照明光仅是扫描中一个非常小的聚焦光点，且亮度、信噪比高，信号光要比物体其他点要强。在像面上，点探测器只能接收通过针孔的光，而来自物体其他部位的杂散光因在共焦针孔处不能聚焦而被滤除。这使得通过共聚焦扫描显微镜得到的样品图像对比度比传统显微镜的要高。

三、共焦显微镜的改进

随着共焦显微技术的发展，出现了一些新的技术，进而出现了很多新结构的共焦显微镜。

3.1 宽视场共焦显微镜

多年来，人们提出了许多提高数据获取速度的方法，大多数采用改变共焦孔径的方法。如果共焦轮廓仪要求很高的轴向分辨率，就必须用到高数值孔径的物镜。但是高数值孔径物镜的缺点就是视场小。

如果用微透镜阵列来取代物镜，如图2所示，则能够实现大(宽)视场的检测。当每一个独立的微观透镜保持较大的NA时，视场由阵列的大小决定。单个透镜的焦距可以用于调节来适应被测对象的形状，减少扫描范围和加快速度。用微镜头代替物镜的系统与典型的共焦显微镜有一点不同，因为光被微透镜焦平面上的每一个物点反射，然后通过透镜聚焦在一个针孔上，该针孔相当于一个空间滤波器。微透镜的光瞳将在相机上成像，而不是像典型的共焦装置的像点。对于这个系统，当物镜NA等于0.3时，轴向分辨率能达到50mm

图2 宽视场共焦显微镜光路示意图

3.2 光谱共焦显微镜

光谱共焦显微镜是为了满足共焦系统通过垂直扫描来确定相对物体高度的位置这一需求发展起来的。其相对于纵向扫描的优点在于光谱共焦显微镜采用了一个有轴向色差的物镜，不同波长的光波通过这种物镜具有不同的焦点位置；只有满足焦点位置与物体位置重合的波长才能反射回系统。因此，这种系统也称为波长-深度的编码装置。这里用光谱仪代替CCD相机来探测波长值。通过测量功率谱来对焦点位置进行及时测量，取代了所有的扫描机制，从而加快了测量速度。图3为光谱共焦显微镜的示意图。

图3 光谱共焦显微镜光路示意图

3.3 差动共焦显微镜

差动共焦显微技术是在1974年由 Dekkers和 De lang最先提出的。图4为差动共焦显微镜的技术原理图。

图4 差动共焦显微镜光路示意图

它是在基本的共焦显微技术基础上，在共焦光路的信息接收端处，将被测信号分为两路，用两个光电转换器以差动方式进行连接，得到聚焦信号。采用差动方式测量共焦信号，可以消除光强漂移和探测器的电子漂移引起的噪声，很大程度上提髙了测量信噪比，从而提高了测量精度。它与扫描探针式共焦测量系统相比，具有误差小、测量范围大、抗干扰的优点，其测量精度髙，可达到纳米量级。此技术兼具高分辨率、大量程、非接触测量的特点。

四、应用

根据共焦显微镜的光路特点，可以利用被测样品在离焦位置和准焦位置探测端信号差异显著的特点实现离焦信号与准焦信号的分离，在每个测量点位置均可通过轴线扫描得到该点的轴向坐标，再结合横向扫描就可实现对被测样品的三维形貌的测量。常规的共焦显微镜基本均能实现该功能。

目前，已有很多公司推出了面向生物医学领域和工业测量领域应用的共焦显微镜产品，主要性能指标列于表1中。

表1 工业用共焦显微镜主要性能参数对比表

参考文献

[1] 郝群编著. 现代光电测试技术[M]. 北京：北京理工大学出版社, 2020.04.

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