【文献阅读】Expanding the mutation and phenotype spectrum of MYH3-associated skeletal disorders

【文献阅读】Expanding the mutation and phenotype spectrum of MYH3-associated skeletal disorders

摘要

MYH3的致病变异会导致远端关节挛缩2A型和2B3型，和挛缩、翼状胬肉和脊椎骨融合综合征类型1A（CPSFS1A）和1B型。这些疾病非常罕见，他们的自然进程和表型差异都没有被很清晰的描述出来过。这篇文章中，作者总结了来自10个不相关家庭的17个患者的临床特征和遗传结果，这些患者患有由MYH3显性或隐性致病变异导致的脊柱畸形。一共发现了12个MYH3新致病变异：3个是新出现的变异或者是常染色体显性遗传，9个是常染色体隐性遗传。患者患有椎体分割异常，伴有可变关节挛缩、身材矮小和面部畸形。 显性和隐性MYH3相关条件在矮小程度和椎体融合数量方面存在显著的表型重叠。所有单等位变异均导致SMAD3磷酸化水平显著降低，这与之前提出的典型TGF-β信号通路受损的致病机制一致。大多数双等位变异被预测为蛋白质截断，而作者发现一个以常染色体隐性方式遗传的错义突变 c.4244T >G,p.(Leu1415Arg)改变p38的磷酸化水平，提示抑制TGF-β信号的非典型通路。 总结一下，作者在来自10个不相关家族中的17个患者中发现的12个新致病突变和他们的重叠表型扩大了MYH3相关骨骼疾病的突变和表型图谱。作者证明了典型或非典型TGF-β信号通路紊乱参与了MYH3相关骨骼融合综合征的发病机制。

简介

• 肌球蛋白重链3 基因 (MYH3) 编码胚胎肌球蛋白的重链，它是一种由球状运动结构域通过短颈和铰链区与长盘绕棒结构域连接而成的肌肉蛋白。

• 胚胎肌球蛋白以二聚体的形式存在，其尾部结构域相互缠绕。

• 数百个这样的二聚体与其他蛋白质组合形成肌节，骨骼肌细胞和心肌细胞的亚细胞收缩装置。

• MYH3在胚胎和胎儿发育期间(从妊娠第6周到第24周)高表达，并在出生后继续在骨骼和心肌以及其他一些组织的mRNA水平和蛋白水平上表达。

• MYH3单等位基因致病变异会导致远端关节弯曲综合征（DA），包括2A型和2B3型。

• MYH3杂合致病变异会导致除DA外其他综合征，CPSFS1A（特征：关节挛缩，多椎体，腕关节和跗骨融合）

• TGF-β信号通路对正常的肌肉功能很重要，而MYH3致病突变抑制此信号通路。

• 近期，MYH3的双等位基因无义变异和剪接缺陷在CPSFSIB中被报道。

• 共29例CPSFSIA和10例1B被报道，我们对CPSFSIA和CPSFSIB的表型和突变谱以及它们的自然临床过程了解得很少。

• 本文中，作者报道了来自10个不相关家庭的17个MYH3相关病例，伴有椎体融合，关节挛缩和多发性翼状胬肉症状，从而扩展表型图谱。 本报道中增加了12个MYH3新致病变异，并通过HEK293T细胞的功能研究提供了支持错义变异致病性的证据。

结果

病原性MYH3变异患者的招募

10个患有先天脊柱畸形和带有MYH3致病变异的家族。
Fig. 1 Pedigrees of the participating families and the pathogenic MYH3 variants detected in the study. In family A, B and C the affected individuals have dominant MYH3-associated skeletal fusion syndrome, in families D, E, F, G, H, I and J the affected individuals have recessive
MYH3-associated skeletal fusion syndrome. The pathogenic variants are summarized in the table below the pedigrees.
A,B,D,E 来自中国，C,F,G,H,I,J来自欧洲。

常染色体显性遗传或新创MYH3变异及患者表现型

A,B,C家族中发现新创或常染色体显性遗传杂合变异。这些均为新发现的变异。

• A家族先证者（A-II:1）
  - 7岁中国男童，GA（胎龄）37+3
  - 骨骼检查发现多椎体融合，短颈伴有翼状胬肉，乳头间距增大，漏斗胸和中等矮小身材
  - 面部特征包括下斜睑裂，高鼻梁，腭裂，耳位低，左手手指下垂。 认知和运动发育正常
  - 杂合MYH3新创变异c.841G>A, p.(Glu281Lys)
• B家族先证者（B-II:1）
  - 10岁男性，GA 38+4，他出生时出现斜颈
  - 骨骼检查显示先天性脊柱侧弯，多椎体融合和中等矮小
  - 大肌肉运动发育轻度延迟，认知发育正常
  - 杂合MYH3新创变异 c.1400A>C, p.(Glu467Ala)
• C家族先证者（C-IV:2）
  - 9岁高加索男性，GA 38+3
  - 出生时关节挛缩和增大，腘窝翼状胬肉，短颈，低位后旋耳，先天性蹼颈，双侧隐睾和单侧腹股沟疝
  - 之后出现脊柱侧弯，脊柱x片显示颈椎、胸椎和腰椎多个椎体融合
  - 他的身高z-score从出生时的-1.5下降到6岁时的-2.9
  - 语言发育较晚，正在接受轻度学习障碍的发展性评估
  - C家庭中有7个患者，均呈现矮小身材，脊柱异常。
  - 所有患者均为MYH3基因的一个框内缺失的杂合子，c.3661_3663delGAG, p.(Glu1221del)，但不存在于正常亲属中。
  Fig. 3 Schematic representation of MYH3 variants in published literature (upper part of the figure) and in this study (lower part of the
  figure). Different colors annotate variants associated with different forms of MYH3-associated conditions.

常染色体隐性遗传及患者表型

• 在2个中国家庭，4个瑞典家庭和1个拉脱维亚家庭（D, E, F, G, H, I, J）中检测到7对经亲本测序验证的复合杂合子变异。
• 9个隐性变异是新发现的，且5个患者中发现c.–9+1G>A （被前人报道过的变异）。
• D家族有两个姐弟患者：
  • D-II:1： 17岁女性，GA 38+5
    • 先天性脊柱侧弯，胸椎畸形和身材矮小
    • 面部特征：鼻梁长，低位耳，耳后旋转，人中突出
    • 不具备关节挛缩
  • D-II:2： 15岁男性，GA 39+2
    • 胸椎椎体融合和左手第五个近端指间关节挛缩
  • 姐弟两人均表现发育缓慢。
  • 它们是MYH3的剪接变体的复合杂合子：c.3249-9_3249-5delTCTTC; c.1582-6A>G
• E家族先证者（E-II:1）
  • 多个胸椎融合，关节挛缩，下斜睑裂，上睑下垂，长鼻，低耳，人中宽
  • MYH3中两个变异的复合杂合子
• F家族先证者（F-II:2）
  • 7岁5个月高加索女孩，GA 41+1
  • 出生时四肢短，胸部宽，乳头间距宽，睑裂向下倾斜，颈部短，伴有轻度翼状胬肉，膝关节和手指伸长率降低。
  • 多个分割异常，椎体和椎间盘高度降低，肋骨异常成角和拥挤，异常骶骨前角
  • 严重的生长障碍
  • 出生起接受持续的物理治疗，行动能力得到改善，不需要任何骨科手术矫正。
  • 认知发育正常，大肌肉运动发育轻度延迟。
  • 最初几年有轻微进食障碍，反复的中耳感染以及反复发作的阻塞性支气管炎。
  • MYH3中两个剪接变体的复合杂合子:c.-9 +1G>A; c.5658 + 3 _5658 + 6。
• G家族先证者（G-II:1）
  • 父母是高加索人，通过第二次试管受精出生（由于母亲卵巢囊肿）。
  • GA 39+2
  • 新生儿体检发现双侧单横掌折痕，骶骨皮肤皱褶伴轻度多毛，左侧轻度髋关节发育不良。
  • 2周时的MRI显示脊柱胸椎侧弯，T2- T4, T6-T8和T10-T12椎块融合弓，T10和T12椎体蝶形。
  • 精神发育正常。
  • 脖子短，肘关节和膝盖挛缩10°，小颌，左侧眼睑下垂和鼻翼发育不良。
  • 28个月时患有远视+3.5D。
  • MYH3中两个剪接变体的复合杂合子:c.–9+1G>A; c.1002+1G>A
• H家族先证者（H-II:2）
  • 4岁女性，父母是高加索人，GA 40 + 6
  • 家族史基本正常，除了母亲有轻度脊柱侧弯
  • 3个月大时发现脊椎畸形，在3岁时被诊断为多椎体融合
  • 有脊柱侧弯，胸部相对较宽，膝盖和臀部挛缩
  • 心理发育正常，4岁时身材轻度矮小
  • MYH3的复合变异杂合子：c.–9+1G>A and c.4000del,p.(Leu1334Cysfs*75)
• I家族先证者（I-II:1）
  • 18岁女性，出生于瑞典，GA 41 + 5，通过诱导分娩和真空抽取
  • 产前超声检查正常
  • 分娩因锁骨骨折而复杂
  • 15个月时身材矮小和脊柱侧弯
  • 从3岁开始，膝关节出现几次疼痛和肿胀
  • 怀疑为幼年特发性类风湿关节炎，3岁8个月至6岁接受甲氨蝶呤等多种治疗
  • 单膝关节轻度5度伸展性缺损，腕关节屈曲受限/僵硬，右肩无法抬起超过160度
  • 从4岁8个月到15岁一直接受生长激素治疗
  • 精神运动发育正常
  • 颈部短，伴有翼状胬肉，胸部宽且相对短，双侧单手掌皱褶，脊柱侧弯，胸椎和腰椎区广泛的椎体异常
  • 患者有双尖主动脉瓣，父亲也有。但是父亲没有任何骨骼发育不良或关节挛曲的迹象，怀疑他的心脏畸形是由另一个尚未确定的遗传原因造成
  • MYH3的复合变异杂合子：c.–9+1G>A and c.5220_5223del, p.(Ser1740Argfs*2)
• J家族先证者（J-II:1）
  • 21岁女性，瑞典家庭中足月出生
  • 一岁时先天性脊柱侧弯明显，脊柱x片显示多个椎体融合
  • 进一步的放射学检查显示有脊髓栓系，在4岁时进行了脊髓栓系松解和垂直可扩张假体钛肋骨联合手术。
  • 胸宽，面部轻微畸形，包括轻度面部不对称
  • 随着年龄的增长，膝盖、臀部、肘部和手指的伸展受限变得更加明显。
  • 出生时的身高正常(z-score +0.2)，但后续生长障碍，最终身高z-score为−2.9
  • 一岁患上了阻塞性支气管炎，目前仍在治疗中
  • 运动和认知发育正常
  • MYH3中两个剪接变体的复合杂合子:c.-9+1G>A; c.4357-10G>A
    Fig. 5 Analysis of the MYH3 splicing abnormalities in families D, E, F, and J.

MYH3相关疾病的常染色体显性和常染色体隐性患者有显著的表型差异和表型重叠

• MYH3相关疾病的常染色体显性和常染色体隐性患者表现出不同程度的椎体融合、矮小和畸形特征。
• 作者将自己的患者的身高数据与文献中的进行比较发现常染色体显性和隐性患者的矮小程度存在重叠。
• 此外，高度z-score从0到−4.4，表明MYH3的致病变异导致轻度到中度的生长失败

错义突变导致TGF-β信号异常

• 作者使用过表达细胞模型检查了本研究中发现的临床意义未知的错义变异。
• 利用MYH3-EGFP融合质粒，作者将含有显性变异(C . 841g >a, C . 1400a >C, C .3661_3663del- GAG)和隐性变异(C . 4244t >G)的突变体转染到HEK 293T细胞中。
• 我们发现这些变异均不影响MYH3、SMAD3的表达，也不影响Erk1/2的磷酸化水平 Fig4 a, b, c, f）
• 与转染对照野生型质粒的细胞相比，转染显性遗传或新生变异的细胞中SMAD3的磷酸化水平显著降低，表明典型TGF-β信号通路受到抑制 （Fig 4e）。
• 我们发现转染隐性遗传变异(c.4244T>G)的HEK 293T细胞中p38磷酸化水平下降，表明非典型TGF-β信号通路受到抑制 (Fig 4d)。
• 这些结果表明，MYH3相关疾病的不同变体可能通过不同的机制发挥作用，即分别干扰典型或非典型TGF-β信号。
  Fig. 4 Expression of MYH3 and proteins in TGF-β/BMP signaling pathway (SMAD3 and phosphorylated SMAD3) in cells transfected with wild-type (WT) and mutant MYH3 plasmid. a Western blot results of MYH3 expression and proteins in TGF-β/BMP signaling pathway in HEK
  293T cells transfected with empty plasmid, WT and mutant MYH3 plasmid. b Quantification of the MYH3 protein. c–f Quantification of TGF-β/BMP signaling pathways alterations on protein expression levels pERK1/2, p-p38, p-SMAD3, and SMAD3. c.841G>A, c.1400A>C and c.3661_3663delGAG variants lead to decreased stimulatory effect of MYH3 on SMAD3 phosphorylation, whereas c.4244T>G leads to decreased p-p38 expression. Western blot data was analyzed as ratios against samples transfected with the WT plasmid. The WT plasmid samples were set at a value of 1. The results are shown as the mean ± standard error of three independent experiments.

由位于准确剪接位点外的变异引起的异常剪接

• 为了确认由位于准确剪接位点外的变异引起的预测异常剪接，我们对c.1582-6A>G和c.3249-9_3249-5delTCTTC进行了微小基因检测。
• c.1582−6A>G变异在第16号外显子之前插入了一个5bp的内含子序列，导致移码和在55个氨基酸后提前出现终止密码子（Fig 5a, b, c）。
• c.3249-9_3249-5delTCTTC则导致25号内含子部分保留(Fig 5d, e, f)。
• 对F家族先证者及其健康父母的cDNA进行Sanger测序，发现其变异c.5658+3_5658 +6del在第39外显子和第40外显子之间存在9 bp的内含子保留(Fig 5g, h)。
• 用SIB ExPASy Bioinformatics Resources Portal的in silico翻译工具预计这个9 bp的包含物会包含两个额外的氨基酸，紧跟着一个终止密码子（Fig 5h)。
• 对J家族先证者及其父母的cDNA测序显示其变异c.4357-10G>A导致跳过32号外显子(Fig 5i, j)。
• 在所有高加索患者中均检测到c - 9+1G>A变异，并伴有其他剪接或移码变异。 该变异已被先前的功能研究报告为致病变异。

讨论

• 在这项研究中，作者报道了12个新的MYH3致病变异，研究了疾病相关变异等位基因的功能后果，并总结了来自10个不相关家庭的17个患者的临床表型。

• 患者表现出不同程度的椎体融合、矮小和畸形特征。

• 临床数据表明，常染色体显性和常染色体隐性MYH3相关疾病患者的矮小程度和融合椎体数量存在显著重叠。

• 这些诊断目前被注释为CPSFS1A和CPSFS1B（OMIM MIM#178110和#618469)。

• 由于两者间存在很大的临床相似性，作者认为这两种孟德尔病实际上代表了同一临床实体的不同表达，因此应该被称为MYH3相关骨骼融合(MASF)综合征，并加以注释两种不同的遗传模式。

• 即使本报告中的患者数量有限，其结果显示了家族间和家族内广泛的表型差异，这表明未来的研究不太可能在常染色体显性和隐性MASF综合征之间找到一致和明确的表型差异。

• 直到最近才发现MYH3变异与CPSFS1A和CPSFS1B相关，大多数MYH3致病变异与DA2A（MIM #193700)和DA2B3(MIM #601680)相关，两者均以肢体挛缩为特征，无椎体异常。

• 在一些DA2A患者中发现脊柱侧弯和身材矮小，表明MYH3相关综合征与关节挛缩之间存在表型连续性，伴或不伴有骨骼融合的迹象。

• DA2A和DA2B3与错义变异有关，这些错义变异主要位于肌球蛋白的头部和颈部区域。

• 与前人研究结果一致，改研究结果表明，MYH3中引起隐性椎体融合的双等位变异更可能是功能缺失（LoF），可能导致蛋白截断或无意义的衰减(NMD)。

• c - 9+1G>A等位基因在CPSFS1B (AR MASF)患者中是复发性变异。（这种变异在芬兰人群中等位基因频率为0.01，在非芬兰欧洲人群中为0.002，在非洲人群中观察到一次，没有在中国队列或东亚患者中观察到）
  -该变异存在于所有AR MASF的高加索患者中，与其他剪接位点或移码变异组成复合杂合子。
  -该变异在芬兰人群中的高MAF似乎与MYH3相关疾病的罕见流行相矛盾。在TBX6相关的先天性脊柱侧弯中也观察到了类似的现象，其中一种罕见的TBX6 无异变异与常见的单倍型组成复合杂合子导致先天性椎体畸形16,17。

• 该变异在纯合子状态下可能不会导致表型异常。

• 作者建议，当具有MASF综合征特征的个体中存在高致病性的trans变异时（尤其是在该变异携带率相对较高的人群中），应探索其亚型变异。

• TGF-β信号被认为是骨骼肌和骨骼发育和功能的关键通路，包括成骨或肌源性分化和再生。特别是，它已被证明可以控制增殖、分化、凋亡、迁移、细胞外基质(ECM)重塑、免疫功能和肿瘤侵袭/转移。

• 这项研究中作者发现引起AD和AR MASF的变体通过不同的机制发挥作用。

• 导致AD型疾病的变异扰乱TGF-β典型信号，而AR型疾病的致病变异要么导致转录本截断，要么干扰非典型TGF-β信号。

• 典型TGF-β信号通过激活I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体，直接磷酸化Smad3，通过典型级联反应启动信号转导。

• 非典型途径介导了丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、细胞外信号相关激酶(ERK)、c-Jun n末端激酶(JNK)和p3823,24的激活。

• 典型TGF-β信号的扰动可能比非典型TGF-β信号带来更有害的缺陷，因为本研究中遗传性常染色体隐性遗传的杂合子变体c.4244T>G, p.(Leu1415Arg)在携带者中不会导致先天性椎体畸形。

• 前人的功能研究表明c - 9+1G>A变异导致MYH3的部分功能缺失。

• 作者假设与MASF隐性形式的变异体在杂合子状态下为无义(例如，蛋白截断变异体或导致NMD的变异体)或亚等位基因(例如，c - 9+1G>A变异体)，因此需要两个受影响的等位基因才能导致表型异常。

• 总结一下，作者提出了MYH3的单等位和双等位致病变异，与先天性椎体畸形患者的异质性和临床重叠特征相关，为MYH3相关骨骼融合综合征发病机制中TGF-β信号受损提供了进一步的证据。

引用：https://doi.org/10.1038/s41525-021-00273-x