知识分享|多色探针熔解曲线法和高分辨率熔解曲线法有什么区别？

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多色探针熔解曲线法（Multicolor Melting Curve Analysis, MMCA）和高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting, HRM）都是基于实时荧光PCR技术的核酸检测方法，但它们在原理和应用上有所不同。

多色熔解曲线分析技术（Multicolor Melting Curve Analysis, MMCA）基于探针法和熔解曲线分析法，结合多色荧光检测，可同时检测一个反应中的多个靶标。其探针采用双标记、自淬灭的TaqMan探针或分子信标。

检测原理为：当TaqMan探针游离于溶液中处于无规则卷曲状态时，或分子信标由于茎部碱基的互补配对形成茎环结构时，探针上标记的荧光基团与淬灭基团相对靠近，因荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)使得荧光信号较弱。而当反应体系中存在靶标序列时，探针与靶标序列互补配对，形成伸展状态，荧光基团和淬灭基团相对远离，发射出较强的荧光信号。

当扩增完成，产物量达到最高峰，荧光信号也最强，此时再对扩增产物进行升温检测，则杂交在产物上的探针与靶标序列逐渐解离，形成无规则卷曲状态，荧光信号逐渐减弱，绘制温度与荧光信号的变化曲线图，即可进行熔解曲线分析。

可以通过设计不同Tm的探针来实现一个荧光通道检测多个靶标的目的。因此可以在常规qPCR实验中实现几重到几十重的中高通量靶标检测的目的。

4重荧光通道检测10个靶标示例

高分辨率熔解曲线法则是一种无需使用序列特异性探针的技术，它利用一种饱和染料对PCR反应产物进行分析。

HRM的基本原理是双链核苷酸（dsDNA）的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsDNA解链行为的改变。通过实时检测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，可以生成不同形状的熔解曲线，从而将PCR产物中存在的差异直观地展示出来。

高分辨率熔解曲线法检测SNP结果示意图

多色探针熔解曲线法（MMCA）和高分辨率熔解曲线法（HRM）在操作流程和实验条件上的主要区别如下：

探针使用：

MMCA：需要使用特异性的荧光标记探针，这些探针在设计时会考虑其熔解温度（Tm值），以便在熔解曲线分析中提供所需的信息。
HRM：不需要使用序列特异性探针，而是利用饱和荧光染料（如LC Green、Eva Green等）对PCR产物进行分析。

PCR扩增：

MMCA：在PCR扩增过程中，探针会特异性结合到扩增产物上。在扩增完成后，通过升温使探针与产物解离，从而获得熔解曲线。
HRM：PCR扩增后，直接对产物进行高分辨率熔解分析，通过监测荧光信号的变化来获得熔解曲线。

数据分析：

MMCA：通过分析不同探针的熔解曲线，可以区分不同的靶序列，包括野生型、纯合突变型和杂合突变型。
HRM：通过分析整个PCR产物的熔解曲线，可以检测到单碱基突变，并且灵敏度可以达到1%-0.1%。

实验条件：

MMCA：需要优化PCR反应体系中的引物浓度，以形成不对称PCR，减少探针的水解，并可能需要特定的荧光PCR仪来实现多色荧光通道的检测。
HRM：需要使用高精度的PCR仪（温度分辨率需要达到0.02~0.1℃，温度均一性同样要求较高，Tm的标准偏差为0.020-0.264℃）来实现高分辨率的熔解曲线分析。

应用范围：