qPCR的数据分析根据应用的不同可以分成相对定量和绝对定量两种。例如,处理组细胞与对照组细胞相比,A基因的mRNA改变了多少倍,这就是相对定量;那如果说在一定数目的细胞中,A基因的mRNA有多少个拷贝,这就是我们说的绝对定量。通常在实验室中用的最多的就是相对定量的方法了。
首先我们先了解一下绝对定量的原理及数据分析流程。
绝对定量的原理和方法
Log(起始浓度)与循环数呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系,即
Log2X0 = Log 2M - Ct Log2(1+En)
-
根据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模板量。
对于绝对定量我们需要确定几个要素:
• 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。
• 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。
• 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应,以确保区分并去除因加样失误导致的误差孔。
• 标记方法的选择 ——SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。
• 实验结果显示 ——扩增曲线;标准曲线;融解曲线(探针法不需要)。
我们以染料法为例,给大家展示在绝对定量中的分析流程:
质粒标准品的制备:
首先设计一对引物从基因组DNA上扩增一段含有目的基因的片段,一般来说这个片段最好是比qPCR扩增的目的片段长100bp左右,然后将扩增的片段连接到载体上构建质粒载体,再转到大肠中进行克隆复制,经过质粒的提取及OD值定量或qubit定量(qubit定量从原理上来说要比OD值测定更准确,因此推荐qubit进行质粒浓度测定,推荐使用启衡星qubit试剂盒,性能优越,稳定),我们就可以将质粒梯度稀释得到一组标准品。
质粒标准品拷贝数的计算及稀释方法
拷贝数的计算
1OD260=50ng/μL双链DNA,待测样本浓度(ng/μL)= OD260