qPCR 数据分析

qPCR的数据分析根据应用的不同可以分成相对定量和绝对定量两种。例如，处理组细胞与对照组细胞相比，A基因的mRNA改变了多少倍，这就是相对定量；那如果说在一定数目的细胞中，A基因的mRNA有多少个拷贝，这就是我们说的绝对定量。通常在实验室中用的最多的就是相对定量的方法了。

首先我们先了解一下绝对定量的原理及数据分析流程。

绝对定量的原理和方法

Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系，即

Log2X0 = Log 2M - Ct Log2（1＋En）

• 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。

对于绝对定量我们需要确定几个要素：

•　一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。

•　一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。

•　重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保区分并去除因加样失误导致的误差孔。

•　标记方法的选择 ——SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。

•　实验结果显示 ——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。

我们以染料法为例，给大家展示在绝对定量中的分析流程：

质粒标准品的制备：

　　首先设计一对引物从基因组DNA上扩增一段含有目的基因的片段，一般来说这个片段最好是比qPCR扩增的目的片段长100bp左右，然后将扩增的片段连接到载体上构建质粒载体，再转到大肠中进行克隆复制，经过质粒的提取及OD值定量或qubit定量（qubit定量从原理上来说要比OD值测定更准确，因此推荐qubit进行质粒浓度测定，推荐使用启衡星qubit试剂盒，性能优越，稳定），我们就可以将质粒梯度稀释得到一组标准品。

质粒标准品拷贝数的计算及稀释方法

拷贝数的计算

1OD260=50ng/μL双链DNA，待测样本浓度（ng/μL）= OD260