RNA及其提取_rna的获取-CSDN博客

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一、RNA的重要性

DNA、RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。

图1 三种主要的RNA

遗传信息从DNA到mRNA并非简单的复读式的传递，而是先生成mRNA的前体——hnRNA，再经过复杂的加工过程，成为成熟的mRNA后再翻译成蛋白质（见图2）。并且RNA不只有传递遗传信息的功能，更在基因表达等过程中发挥调控的作用，指令制造的蛋白质可以抑制或者促进肿瘤生长，甚至有部分病毒的复制和部分神经系统疾病亦与RNA有关。因此在RNA水平上的检测和研究是非常有必要的，通过总RNA提取可获得高纯度及高质量的总RNA，可用于实时荧光定量PCR、Northern blot、microRNA检测、芯片分析，RNA文库构建，基因克隆等实验。

图2 mRNA前体加工过程

RNA的提取

RNA提取常用的方法是Trizol法提取（即异硫氰酸胍-苯酚法）。它的原理是在强变性剂异硫氰酸胍首先使细胞裂解，并使核蛋白复合体中的蛋白变性。在特定pH条件下，由于DNA和RNA的溶解度不同而被分离，DNA位于中间相，RNA位于水相，再有机溶剂来沉淀RNA即可得到纯度较高的RNA。

图3 Trizol法提取RNA 流程

但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。针对RNA酶污染的一些注意事项：

1）研磨组织块用于RNA 提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，如采样后，不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-80℃的冰箱中保存。

2）注意冰上操作，低温离心。

3）使用RNase-free溶液；

4）设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。。

5）如果可能，在超净台中按照细胞培养的要求进行操作，可以有效避免操作中引起的RNA酶污染。

6）操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

7）尽量使用无RNA酶的一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等，以防交叉污染；玻璃器皿可在180°C以上温度下烘焙数小时，或用新鲜配制的0.1%（v/v）DEPC或无水乙醇浸泡一小时后，高压灭菌去除残余的DEPC；电泳槽等含聚碳酸脂或聚苯乙烯材料的器皿应该在3%的过氧化氢中浸泡10 min，然后用大量的RNase-free水冲洗干净后使用；塑料制品可用新鲜配制的0.1%（v/v）的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌1 h水解残留的DEPC。

8）无水乙醇、异丙醇等试剂开瓶后作RNA专用；75%乙醇应使用无水乙醇与DEPC处理水配制。

三、RNA的质控

1、定量质控

目前实验室最常用的几种量化方法，如分光光度法(e.g. NanoDrop)，微流控分析法(e.g. Agilent 2100)，或者荧光染料检测法（e.g. Qubit 3.0）。