qPCR中荧光标记的选择

实时荧光定量PCR是一种监控核酸扩增的技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。

PCR反应液加入了各种类型的荧光标记物：

在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强：

 说到荧光定量PCR技术，我们经常会问类似于“你的实验是染料法还是探针法”，“你用的探针是什么类型”等之类的问题，这其实是对荧光标记的选择。根据荧光标记的不同，可以将荧光定量PCR实验分为染料法和探针法两大类。

1、染料法

染料法利用能与DNA双链结合的染料来实现，如SYBR Green I。该染料在游离状态下呈现微弱的荧光，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其绿色荧光增强约1000倍。因此其总的荧光强度与双链DNA含量成正比，利用这一关系可以反映生成的PCR产物的量。SYBR Green I的最大吸收约在497 nm，发射波长最大约在520 nm，与FAM荧光分子的光谱性质类似，因此在所有的荧光定量PCR设备中都是第一通道检测，即“FAM/SYBR Green I”通道。

 

 2、探针法

TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收; PCR扩增时, Tag酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

 常用的荧光标记基团及淬灭基团见下表：

标记Taqman探针的常见荧光基团

Taqman 探针的常用淬灭基团

 在选择了探针的荧光基团后，可以根据荧光基团的类型来匹配猝灭基团。多个qPCR不需要不同的猝灭基团。例如，在两个qPCR中选择FAM和VIC为荧光基团，可以统一选择BHQ-1作为猝灭基团。