知识分享|多色探针熔解曲线法在药物代谢酶基因多态性检测领域的应用

1、基因多态性

药物代谢是影响药物作用的主要因素之一，由基因控制的药物代谢酶是药物代谢中重要的催化剂。不同个体因为基因多态性的存在，在药物代谢酶水平上会存在差异，进而影响药物的疗效和安全性。

因此，对影响药物代谢酶相应基因多态性进行研究有非常重要的临床意义。

2、基因多态性的分析方法

目前，基因多态性分析的方法主要有限制性片段长度多态性分析(RFLP)、 单链构象多态性分析(SSCP)、PCR-ASO探针法、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、基因芯片技术、实时荧光PCR技术、DNA测序等，这些传统的技术不但操作繁琐，而且需要PCR后处理，从而限制了在实验室或临床上的应用。

多色探针熔解曲线分析技术因其快速、简便、准确、低成本等优点，在基因多态性分析上具有很大的优势。

3、应用案例

本文将以李庆阁实验室的研究-多色探针熔解曲线分析技术在华法林和氯吡格雷药物敏感性SNP位点的检测上的应用为例，来说明多色探针熔解曲线分析技术在代谢酶基因多态性分析上的应用前景。

华法林是一种广泛使用的治疗和预防血栓栓塞性疾病的口服抗凝剂，其治疗窗口较窄，个体差异较大，剂量调整困难。氯吡格雷抗血小板疗效的个体差异也比较大，部分患者表现出低反应或无反应（即氯吡格雷抵抗），该现象受细胞色素P450酶基因（如CYP2C19）多态性影响。

中国人群常见的华法林易感基因的多态性和4种氯吡格雷易感基因的多态性，分别是

VKORCl-1639G>A、CYP2C9*3、CYP2C9 IVS3-65G>C、CYP4F2 1297C>T和 CYP2C19*2、*3、*17、CYP3A5*3。

针对华法林4个药物敏感性SNP位点，李庆阁老师实验室研究人员设计了4对引物和4条探针，实现多种不同荧光标记的探针在单个反应管中对多个不同区域的多种突变的检测。

针对氯吡格雷4个药物敏感性SNP位点，也设计了4对引物和4条探针，实现了单管检测氯吡格雷4个药物敏感性SNP位点。

图1.法华林敏感基因多态性检测(MMCA法)流程(a)及各多态性位点的典型基因分型结果(b)

 

a-d:分别为FAM、HEX、CY5、ROX通道的扩增曲线，e-h分别为对应的溶解曲线分析结果；各图中箭头指示方向加入的人基因组DNA量依次为50, 5, 0.5, 0.05, 0.005ng，灰色曲线为未加模板的阴性对照。 

图2.法华林敏感基因SNP检测体系(MMCA法)的灵敏度分析。 

w：野生型；M：突变型；H：杂合型；

图3.多色探针熔解曲线法检测氯吡格雷药物敏感性SNP的结果。 

图4.氯吡格雷药物敏感性基因SNP检测体系（MMCA法）的灵敏度分析。（方法同图2）

 研究人员又用所建立的监测体系对中国地区127分随机人类基因样本进行检测，结果如下（表1），同时挑取部分样本进行测序验证，验证结果与MMCA检测结果一致。

表1.127例样本检测结果及各SNP位点的频率统计表 

总结

总之，本研究以华法林和氯吡格雷药物易感基因的多种SNP位点为检测对象，充分考察了多色探针熔解曲线分析用于多种突变检测的可行性。

通过对这两个单管体系的建立、优化及评价，进一体现了探针熔解曲线分析技术具有快速、简便、准确、低成本等优点，对临床用药有很好的指导意义。

多色探针熔解曲线分析的优势

多色探针熔解曲线分析技术通过结合Tm多重检测和多色荧光检测，极大提高了单管实时PCR所能检测的靶的数目或突变个数，具有快速、简便、高通量、低成本、稳定且不易造成污染等优点。

该方法不仅适合用于药物基因组基因多态性分析，还可以应用到临床检测的各个领域，包括病原微生物的基因分型、肿瘤基因突变检测、微生物耐药突变检测、甲基化检测等。此外，该方法不仅适合用于己知突变的检测，还可以扩展应用到对未知突变的筛查和检测。