第二章 基因芯片

基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片/组织芯片/糖芯片/其他芯片。这三个属于微阵列芯片。
芯片实验室属于微流控芯片。
基因芯片按照探针的不同分为寡核苷酸微阵列和cDNA微阵列。寡核苷酸微阵列——更常用。
基因芯片技术的基础是DNA杂交技术。
核酸分子固相杂交方法：正向杂交和反向杂交(基因芯片的前身)。
反向杂交固定的是探针，用样品去检测。
正向杂交固定的是样品，用探针去检测。
基因芯片流程：1.样品制备和芯片制备；2.杂交；3.杂交信号检测；4.数据分析
探针——要有特异性，通常用单链DNA。
固相支持物——载体：高密度，活性基团，惰性，生物相容性，光学性质。
刚性支持物、膜性支持物、膜结合玻片(非共价键不可逆结合)。
膜——western中用到转膜，自身和核酸有亲和性。
玻+硅——稳定性。
生物样品的固定：原位合成、合成后微点样。
原位合成适用于寡核苷酸：1.原位光蚀刻合成；2.原位喷印合成
合成后微点样法适用于：大片段DNA、寡核苷酸、mRNA：1.接触式点样（针式打印）；2.非接触式点样（喷墨打印）
DNA带负电，通过静电作用与载体相偶联。
生物素和链霉亲和素相偶联。
末端标记、随机插入、缺口平移。
大肠杆菌DNA聚合酶I的活性：
1.5’到3’DNA聚合酶活性
2.5’到3’外切核酸酶活性
3.3’到5’外切核酸酶活性
Affymetrix公司的Genechip有两个主要特点：光蚀刻原位合成技术、独特的PM-MM探针方案。
PM-MM探针设计的优势：特异性好、灵敏度高、定量准确、重复性好。

简单介绍Affymetrix公司进行探针原位合成的方法。
Affymetrix公司的基因芯片中合成寡核苷酸探针采用的是光蚀刻原位合成技术。该法利用光敏保护基来保护合成碱基单体的5’羟基端。第一步是先利用光照射使固体表面上的羟基端脱保护，然后5’端保护的核苷酸单体连接上去，合成（通过化学偶联）只在那些脱保护基的地方进行，光照区域就是要合成的区域，而被光蚀刻掩膜遮挡的区域则不进行合成。该过程通过一系列掩膜来控制，每轮加入1个dNTP，如此循环反复进行直至合成达到设定的寡核苷酸长度停止。每个寡核苷酸片段代表了一种特定的探针存在于基因芯片的特定位置上，可合成任意序列15-25nt长度的片段，再多就不易识别一个碱基的差异了。此法最大优点即可以在较小的区域内制造大量不同的探针。