chapter2 基因组学

1.基因、基因组与基因组学基因gene：遗传的基本单位，编码RNA或多肽链的核酸片段。基因组genome：细胞或生物体所含的一套完整的单倍体遗传物质。基因组DNA：编码蛋白的结构基因、复制转录的调控序列、功能尚不清楚的区域。基因组的特点：（1）不同的生物体，其基因组大小和复杂程度各不相同。（2）进化程度越高的生物其基因组越复杂。基因组学genomics：1986年提出，定义为研究基因组的结构组成、时序表达模式和功能，并提供有关生物物种及其细胞功能的进化信息。基因组学包含3个不同的亚领域：结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学。2.人类基因组计划HGP人类的五种模式生物：大肠杆菌、果蝇、小鼠、线虫、酵母。HGP最初目标：15年内（1990-2005）投入30亿美元，完成人类24条染色体的30亿个核苷酸序列分析。HGP终极目标：解码生命、了解生命、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。HGP的研究目标：绘制人类基因组的高分辨遗传图谱；绘制人类及某些模式基因组的各种物理图谱；确定人类及某些模式生物的DNA全序列；收集、存储、传播和分析所得资料、发展用于此研究的一系列新技术。2000.6.26克林顿宣布人类基因组草图绘制完成。人类基因组草图基本信息：人类基因组：由31.65亿bp组成；含3-3.5万基因；与蛋白质合成有关的基因占2%。人类蛋白质：61%与果蝇同源；43%与线虫同源；46%与酵母同源。人类基因组研究成果表明： 1.基因数量少得惊人 2.人类基因组中存在“热点”和大片“荒漠” 3.三分之一为“垃圾”DNA 4.种族歧视毫无根据 5.男性基因突变比例更高HGP的技术成果：主要体现在对人类基因组整体结构的认识，即人类基因组遗传图、物理图、转录图、序列图的完成，从而奠定了人类结构基因组学基础。而人类基因图的完成，仍有大量工作要做。3.基因组作图基因组计划的第一个环节：构建基因组图谱。（分散测序，图谱指导）基因组作图：应用界标或遗传标记对基因组进行精细的划分，进而标示出DNA的碱基序列或基因排列。遗传图谱genetic map（原理、目标）：又称为连锁图谱或遗传连锁图谱，指基因组内基因或DNA标记在染色体上的相对位置与遗传距离。遗传图距的单位：厘摩（cM）。早期绘制的经典遗传图谱的单位是重组率，1%的重组率为1个遗传单位。现代遗传图谱的单位为厘摩，1cM相当于1%的重组率，约为一百万个碱基对。重组率=减数分裂的重组产物/减数分裂的总产物。构建遗传图谱的基本原理：连锁分析是遗传作图的基础。
1. 真核生物遗传过程中会发生减数分裂，此过程中染色体要进行重组和交换，这种重组和交换的概率会随着染色体上任意两点间相对距离的远近而发生相应的变化。
2. 重组率可称为测量基因之间相对距离的尺度，只要获得不同基因之间的重组率，就可绘制一份基因位于染色体上相对位置的地理图。
3. 我们得到的这张图谱也就只能显示标记之间的相对距离。我们称这一距离（概率）为遗传距离cM，由此构建的图谱也称为遗传图谱。

遗传图谱的意义：提供基因在染色体上的坐标，为基因识别和基因定位创造了条件。遗传作图的DNA（分子）标记：特征：个体间存在着多态性（即差异），也就是说具有可识别性，该多态性在后代中可以重演，即具有可遗传性。第一代：限制性片段长度多态性RFLP同源染色体同一区段DNA序列的差异；限制酶识别的碱基顺序有专一性。第二代：简单序列长度多态性SSLPs：小卫星序列；微卫星序列SSLP：是一系列不同长度的重复序列，不同的等位形式含有不同数目的重复单位。小卫星：也称为可变数目的串联重复，重复单位长度为几十个核苷酸。微卫星或简单串联重复（STR）：它的重复单位长度短得多，通常为二、三或四核苷酸单位。微卫星比小卫星更常用作DNA标记。微卫星多态性遗传标记，又称简单序列重复标记（SSR），最重要的优点是高度多态性。微卫星序列MS第三代：单核苷酸多态性标记SNP点突变，位于密码子的摇摆位置，表现为沉默突变而被大量保留下来。大多数不能被限制酶识别，必须采用测序或寡聚核苷酸杂交检测。在人类基因组中可达到300万个，平均每1000个碱基对就有一个。数目多，覆盖密度大，它的开发和应用摒弃了遗传标记分析技术的“瓶颈”凝胶电泳，为DNA芯片技术应用于遗传作图提供了基础。遗传作图的方法：有性杂交实验；系谱分析；DNA转移。物理图谱：以定位的DNA标记序列如STS作为路标，以DNA实际长度即bp、kb、Mb为图距的基因组图谱。遗传图谱分辨率有限；遗传图谱精确度有限。物理图谱定义：以一段已知核苷酸序列的DNA片段（限制性酶切位点、序列标签位点等）为标记，以Mb或Kb作为图距绘制的基因组图。基本要素：路标（限制性酶切位点和STS等）、单位、顺序、可复制的DNA片段。物理作图的方法：（作图方法，原理）1.限制酶作图（小分子）只能应用于相对较小的DNA分子，对于DNA分子长度<50kb的片段，一般没有什么困难。而对于>50kb的DNA分子，可选用稀有切点内切酶酶切DNA。2.序列标记位点作图——大基因组物理图主流构建技术
1. 序列标记位点（STS）：指一段短的DNA序列，通常长度在100-500bp，易于识别，在待研究的染色体或基因组中仅存有1个拷贝。因此当2个片段含有同一STS顺序时，可以确认这两个片段彼此重叠。
2. 序列标记位点作图：通过PCR或分子杂交将特定DNA顺序定位在基因组染色体区段中。
3. 作图方式：克隆作图、辐射杂交作图。

STS图谱构建的步骤：
1. 确定各STS序列及其在基因组中的位置（基因组数据库GDB中至少含有24568个STS路标信息）
2. 插入大片段基因组文库的构建（BAC文库）
3. 以特定STS为标记筛选并定位克隆
4. 含有STS的克隆在基因组中排序

文库的概念：含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。宿主：能容纳外源DNA片段的生物体，常用的有大肠杆菌、酵母等。载体：能携带外源DNA进入宿主细胞的工具，常用的载体有质粒载体、噬菌体载体、细菌人工染色体等。构建图谱的载体与方法利用不同水平的克隆方法，将染色体分解成可测定顺序的形式。克隆方法：放射杂交株，酵母人工染色体、细菌人工染色体、黏粒、噬菌体和质粒可克隆DNA片段大小：大片段、100-2000kb、80-350kb、31-45kb、20kb以下YAC载体：酵母人工染色体，是物理作图中最早利用的大片段DNA载体。优点：容量大，插入片段可达1400kb缺点：转化效率低、插入子稳定性差、嵌合克隆比例高，达48%、插入DNA的制备相当困难。BAC载体：细菌人工染色体，是物理作图中目前用得最多的大片段DNA载体。优点：单拷贝复制，不会因重组发生嵌合；插入DNA的提取简单，便于机械化操作。黏粒cosmid：也叫柯斯质粒，含有粘性位点的质粒重组体。序列图谱：通过基因组测序得到的，以ATGC为标记单位的基因组DNA序列。以某一染色体上所含的全部碱基顺序绘制的图谱。既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的综合。转录图谱：利用EST表达序列标签作为标记所构建的分子遗传图谱。把mRNA先分离、定位，再转录成cDNA，cDNA片段又称表达序列标签EST，因此转录图也称为表达序列图。意义：
1. 可以了解基因的精确位置和功能。
2. 可以了解基因的时空表达情况。
3. 可以了解正常情况和不正常情况下的基因表达情况

4.基因组学研究方法——测序测序策略：全基因组散弹法（whole genome shot-gun）、克隆重叠群法（clone by clone）。测序技术：第一代测序技术、第二代测序技术、第三代测序技术。全基因组散弹法：鸟枪法1.将大片段DNA用机械方法随机切割成2kb左右的小片段；基因组DNA。2.把这些DNA片段装入适当载体，建立克隆文库；散弹状克隆。3.从中挑选克隆进行测序；测序并进行全基因组序列组装。4.最后通过克隆片段的重叠序列组装成大片段DNA序列。完整的基因组序列。优点：（1）不需要高密度的图谱（2）速度快、简单、成本低缺点：拼接组装困难，尤其在重复序列多的区域，主要用于重复序列少，相对简单的原核生物基因组。克隆重叠群法：对于大基因组而言，可以先将基因组DNA分解为若干个较大的DNA片段，构建基因组文库。每个大片段克隆可以独立进行鸟枪法测序，亦可以组建重叠群后进行鸟枪法测序，因此称为克隆重叠群测序法。它是在鸟枪法的基础上发展起来的。1.基因组DNA2.BAC文库3.根据物理图谱正确定位的BAC或contig4.用于散弹法测序的候选克隆5.用于散弹法测序的亚克隆6.测序并组装7.完整的基因组序列两种大规模基因组测序策略的比较第一代DNA测序技术：sanger测序方法的原理第二代DNA测序技术：三大测序平台的工作原理及操作步骤第三代DNA测序技术：单分子测序的特点及应用前景（1）第一代测序sanger法：双脱氧链终止法sanger法基本原理：
1. 核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制，如果在反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可以继续延长。
2. 如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
3. 反应终止后电泳，分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

sanger第一步：加入复制终止剂ddNTPs改进的sanger法：用四种荧光素标记四种ddNTP，测序结果直接被荧光探测器读出sanger第二步：荧光检测跑得快慢表示长短不同；同一个起点开始复制，短的表示在前头，长的表示在后头，根据荧光定序列。（2）第二代测序技术流程：将目的DNA剪切成小片段——单个小片段DNA分子结合到固相表面——单分子独立扩增——每次只合成一个碱基并检测信号——将信号转换为DNA序列核心思想：边合成边测序第一代测序与第二代测序比较第一代测序：（1）需要连接、转化、筛选、分离DNA等（2）一次只针对一条序列测序（3）数据量小，成本高第二代测序：（1）连接接头、PCR（2）大规模平行测序，可同时检测上百万条（3）高通量，成本低，速度快第二代测序技术的优点：高通量，并行测序单克隆测序：文库中的每个片段，最终单独获得一个序列。相比一代测序，二代测序不需要进行挑取单克隆的实验，即获得每个片段的序列。第二代测序技术：illumina测序平台（桥式PCR）、ion torrent测序平台、454测序平台、solid测序平台（这三个都是乳液PCR）illumina测序平台：单分子簇的边合成边测序SBS技术
1. 利用荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，基于可逆终止化学反应原理，实现每次只合成一个碱基

1. 利用单分子阵列实现在小型芯片（flow cell）上进行PCR反应
2. 关键技术：桥式扩增、边合成边测序（SBS）

测序流程：文库制备（片段化、加接头DNA，3’端加A，5’端加上磷酸基团）；生成DNA簇（与flow cell结合、桥式扩增）；测序（边合成边测序）；数据分析illumina测序的基本原理：可逆终止法，边合成边测序每次循环只合成一个碱基，每个循环分3步：（1）带有荧光的游离核苷酸合成（2）成像（3）切除阻断基团和荧光物质454测序平台：焦磷酸测序（ppi）、边合成边测序一个片段=一个磁珠=一条读长。油包水的混合物=微反应器。ion torrent平台：第一个不需要光学检测系统的商业测序仪；采用半导体微孔测序芯片；核心技术：半导体测序。1.文库制备：建库接头是平头，加入P1接头（连接测序珠子）同时加入X（有barcode序列）或A接头2.乳液PCR：引物5’端标记生物素，用于微珠分离3.测序：ion torrent测序芯片是一个半导体芯片，每个小孔可容纳一个微珠测序原理：DNA聚合酶将一个核苷酸掺入到DNA分子中就会释放出一个质子，导致局部可被检测的PH值变化第二代测序技术的缺陷测序耗时过长、耗费大量试剂、依赖PCR扩增，测序前准备工作变繁琐、PCR扩增的错误和偏好、PCR克隆内的分子在测序过程中同步性逐步下降，限制了测序的读长。第三代DNA测序技术：核心思想：单分子测序（SMS）；不需要PCR扩增Pacific biosciences：SMRT（单分子实时测序）基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体进行测序反应基本原理是：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种dNTP（磷酸基团修饰），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。SMRT芯片是带有15万个ZMW（零模波导）孔的金属片，将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反应。Oxford Nanopore technologies：纳米孔单分子技术；基于电信号的检测。单链核苷酸分子穿过蛋白孔道时会造成局部电流改变。lead adaptor带领测序分子进入由酶控制的纳米孔hairpin adaptor的作用是DNA双链测序的保证基因预测基因预测的有效方法——电子克隆利用生物信息学技术组装延伸ESTs序列，获得部分乃至全长cDNA序列进一步利用RT-PCR方法进行克隆分析，验证。结构基因组学：HGP。遗传 物理 转录 序列功能基因组学：利用结构基因组学所获得的各种信息，建立与发展各种技术和实验模型来测定基因及基因非编码序列的生物学功能。预测新基因比较基因组学：通过模式生物基因组和其他生物（人类）基因组之间的比较与鉴定，进而研究生物进化和分离人类遗传病的候选基因，以及预测新的基因及基因功能。比较基因组学的研究方法：系统发育谱法、基因邻居法药物基因组学：研究基因序列多态性和药物效应多态性之间关系