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Comparative cytological and transcriptomic analysis of pollen development in autotetraploid and diploid rice.pdf
《植物生殖》
同源四倍体和二倍体水稻花粉发育的比较细胞学和转录组学分析
2014年9月28日发表

摘要：同源四倍体水稻具有比二倍体水稻更大的遗传变异和更高的活力，但花粉育性低下是同源四倍体水稻产量低的主要原因之一。对同源四倍体水稻花粉育性低下的分子机制知之甚少。本研究采用细胞学观察和基因芯片分析的方法，对同源四倍体和二倍体水稻花粉发育过程中的遗传变异进行了评估。在同源四倍体植株的减数分裂过程中，发现了许多异常的染色体行为，如断裂点、落后染色体、细胞分裂不同步等。同源四倍体水稻的小孢子和小配子的发生与二倍体水稻相似，但在小孢子退化、多孔径和细胞壁异常等方面，同源四倍体水稻存在着许多不同的异常现象。与二倍体水稻相比，同源四倍体水稻在花粉转录组中共有1251个基因差异表达，其中上调和下调的基因分别为1011个和240个。在花粉发育的3个时期分别有124和6个基因共同上调和共同下调。这些结果表明，花粉发育过程中，多倍体诱导了大多数基因的表达上调。根据基因本体论分析，定量RT-PCR验证从功能类别中选择的12个差异表达基因。这些稳定表达的基因不仅与花粉发育基因有关，还参与细胞代谢、细胞生理、结合、催化活性、分子转导活性和转录调节因子活性等。本研究表明，一些关键基因的差异表达可能导致同源四倍体水稻复杂的基因调控和花粉发育异常。

关键词：同源四倍体 水稻 减数分裂 微阵列 小配子发生 PMC

介绍：多倍体在植物进化和生物多样性中发挥着重要作用，超过70%的被子植物物种在进化过程中经历了全基因组复制。倍性的增加提供了基因组缓冲、等位基因多样性和杂合度来加速植物进化。根据加倍基因组的起源，同源多倍体和异源多倍体是两种形式的多倍体。由二倍体水稻（2n=2x=24）经秋水仙素染色体加倍获得的同源四倍体水稻（2n=4x=48）具有增产增肥的巨大潜力。同源四倍体水稻比二倍体水稻表现出的更大的遗传变异和杂种优势，如较大的籽粒、较高的生物量产量、较高的蛋白质、较高的千粒重，且氨基酸含量优于原二倍体对应。然而，结实率低是限制同源四倍体水稻利用的主要因素。
在开花植物中，雄性生殖发育包括雄蕊的形成和花药组织的分化。在花药内，雄性造孢细胞经过减数分裂产生小孢子，小孢子进一步产生花粉粒。花药开裂使成熟花粉粒从雄蕊中释放出来，从而允许授粉发生。花粉育性在同源四倍体水稻双受精的植物育性中发挥重要作用。低花粉育性可显著降低二倍体和同源四倍体水稻的结实率。细胞学观察表明，花粉母细胞减数分裂中异常染色体行为和异常微管分布模式的比例较高是同源四倍体水稻花粉育性底下的重要原因。然而，至今尚未对同源四倍体水稻花粉发育进行系统的细胞学观察和分子遗传学分析。
使用DNA微阵列和RNA-seq技术进行转录组分析的最新进展为更好地理解发育过程提供了机会。微阵列使得在一个实验中分析和比较数千个基因成为可能，这确保了在基因组范围内更好地理解生长和发育的基本方面。微阵列分析已在其他一些同源四倍体物种中进行，并显示出二倍体和相应的同源四倍体之间的基因表达差异。然而，关于同源四倍体水稻花粉发育的转录组学分析，目前尚无相关资料。因此，本研究计划在形态学、细胞学和分子水平（转录组学分析）上研究同源四倍体（Taichung65-4x）和二倍体水稻（Taichung65-2x）的花粉发育。本研究结果有助于从形态学、细胞学和分子水平上解释二倍体水稻与同源四倍体水稻的区别和联系。
材料与方法：植物材料
本研究选用同源四倍体水稻Taichung65-4x和二倍体水稻Taichung65-2x。同源四倍体水稻Taichung65-4x是由秋水仙素对Taichung65-2x的染色体加倍而开发的，在本实验室自交20多代。Taichung65-2x是著名的二倍体水稻品种，并作为对照（CK）。所有材料均在华南农业大学实验农场（SCAU）自然条件下种植，并根据该地区的建议遵循管理规范。
表型测定分析：
共设计了10个表型图，检测了同源四倍体和二倍体水稻的表型差异，即有效穗数、千粒重、株高、旗叶长、旗叶宽、穗长、粒长、粒宽、粒长宽比和花粉育性。这些形状是从水稻的描述符和数据标准中选择的，以描述同源四倍体和二倍体水稻品种之间的遗传变异。
染色体行为观察：
以水稻植株的幼芽为材料，在其旗叶垫与第二至最后一个叶垫之间有-2~2cm的距离，采集染色体行为观察缺陷，在Carnoy溶液（乙醇：乙酸 3:1 v/v）中固定至少24h，然后将样品在4°C的70%乙醇中保存，用镊子和解剖针将花药从小花中取出，置于玻璃载玻片上的一滴1%乙酸胭脂红中。3-5分钟后，用载玻片盖覆盖载玻片，并在显微镜下检查，根据He et al.(2011a)对减数分裂阶段进行分类和解释。
小配子发生观察：
从水稻植株的枝条上收集营养物质，在它们的旗叶垫和第二到最后一个叶垫之间有-4到20cm的距离，并保存在装有潮湿滤纸的培养皿中。用镊子和解剖针将花药从小花中取出，置于载玻片上的一滴10mg/l伊红B（C20H6N2O9Br2Na2，FW 624.1，细胞颗粒和核仁组织染色）溶液（溶于4%蔗糖）中。10分钟后，用玻片盖覆盖载玻片，并在Leica SP2激光扫描共聚焦显微镜（Leica Microsystems, Heidelberg, Germany）下扫描。激发波长为543nm，发射光检测在550和630nm之间。

组织收集和RNA提取：
从二倍体和同源四倍体水稻上采集花药，用荧光显微镜观察花粉发育过程。二倍体和同源四倍体水稻花药发育的分类见表1，收集后将花药置于试剂盒格氏试剂脂质体中，-80℃中保存直至RNA分离。所有样本均重复采集3次，通过甲醛琼脂糖凝胶电泳评估高RNA质量，并通过分光光度计定量。
微阵列分析：
Affymetrix芯片分析用于鉴定二倍体和同源四倍体水稻在花药发育过程中基因表达的差异。每个微阵列包含54000个探针组，包含47000个基因。从花药中分离出2ug总RNA，并使用Affymetrix基因芯片杂交箱640对微阵列进行杂交。基因芯片阵列清洗和染色根据制造商的协议。使用基因芯片操作软件（GCOS 1.4）分析杂交数据。首先通过目视检查对扫描图像进行评估，然后使用GCOS1.4的默认设置进行分析，生成保存为CEL文件的原始数据文件。使用DNA-chip分析仪进行不变集标准化程序，以标准化不同的阵列。
在本研究中，二倍体水稻与同源四倍体水稻在花粉发育过程中表达上调或下调两倍以上的基因被认为是差异表达基因。筛选出差异表达基因后，按cluster 3.0进行聚类分析，将gene ontology （GO）术语赋予不同倍性水平的差异表达基因，分为分子功能、细胞组分和生物学过程3个水平。
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析
选择的候选基因的表达用实时定量PCR测定。来自微阵列分析的12个候选基因用与微阵列分析相同的RNA样品通过qRTPCR验证。使用Transcriptor first strand cDNA Synthesis Kit（Roche）从总RNA合成第一链cDNA片段。利用primer Premier 5.0软件根据目的基因序列设计13对基因特异性引物。用Lightcycler480进行qRT-PCR，最终体积为20ul，每个包含2ulcDNA，10ul 2×Sso。加入高级SYBR Green Supermix（Bio-RAD）和10uM正向和反向引物。反应条件为：95℃下30s，95℃下变性5s 40个循环，58℃退火延伸20s，以水稻泛素基因为内对照。用2-DDCt法计算基因的相对表达量。每个PCR反应重复三次。
结果：
同源四倍体水稻的倍性水平和细胞学和表型变化的检测
通过使用流式细胞术进行染色体分析证实了同源四倍体水稻和对照二倍体水稻的倍性水平。流式细胞术分析结果显示同源四倍体的DNA含量比二倍体水稻高两倍（补充-1图1）。在减数分裂间期（PMA），减数分裂（MA）和单个小孢子期（SCP）期间，同源四倍体水稻的花药和花粉长度显著高于二倍体水稻（表1）
同源四倍体水稻与二倍体水稻中的24条染色体相比具有48条染色体，并且在整个生长期间显示其倍性水平的稳定性（图1a，b）。同源四倍体水稻的稻米花粉粒度，花药和小孢子囊宽度也高于二倍体水稻（图1c，d，补充-1图2，表S2）

该千粒重，叶片宽度，粒长和粒宽的表型变化显著大于二倍体水稻。同源四倍体水稻千粒重，叶片宽度，粒长和粒宽的平均值分别比二倍体水稻高26.62,20.25,40.97和2.01％，然而，同源四倍体水稻的株高显著低于单一二倍体水稻。总之，同源四倍体水稻显示出比二倍体水稻显著更大的差异。
同源四倍体水稻PMC
减数分裂的染色体行为：
为了研究二倍体和同源四倍体水稻中PMC的遗传变异，观察了PMC的染色体行为。Taichung65-2x的减数分裂可分为10个阶段，前期I，粗线期，双线期，终变期，中期I，后期I，末期I，前期II，中期II，后期II，末期II，Taichung65-4x的PMC中的减数分裂也与原始二倍体水稻相似，但同源四倍体水稻PMC中染色体的配对和分离不同于原始二倍体水稻。二倍体水稻，同源四倍体水稻中发现多种多样性和单一化，并且同源四倍体水稻的染色体大小存在差异。
在终变期和中期I中，Taichung65-2x和Taichung65-4x之间的染色体构型存在显著差异。与Taichung65-2x相比，在Taichung65-4x中观察到不同种类的染色体异常。染色体异常的主要类型包括：中期I染色体分离，后期染色体滞后I，染色体滞后于I期，中期II和后期染色体不同步II和末期II的异常细胞形状。

进一步研究观察了二倍体和同源四倍体水稻在七个阶段中的异常染色体行为（表4）。在减数分裂I期间，染色体异常的平均频率分别比中期I，后期I和末期I的二倍体水稻高22.45,19.51和9.13％，而在减数分裂II中，染色体异常的平均频率非常高。同源四倍体水稻比二倍体水稻在中期II（29.82％），后期II（22.73％），末期II（8.62％）和四分体（51.16％）。
同源四倍体水稻的微量发生
采用共聚焦激光扫描显微镜（WE-CLSM）的曙红B染色方法观察二倍体和同源四倍体水稻的微小发生。减数分裂阶段后（图4a），台中65-2x的微小细胞发生可分为7个阶段，早期小孢子阶段（图4b），中部小孢子阶段（图4c-e），晚期小孢子阶段（图4f） ，g），早期双细胞花粉阶段（图4h），中部双细胞花粉阶段（图4i，j），晚期双细胞花粉阶段（图4k）和成熟花粉阶段（图4l）。然而，台中65-4x的微小配子不仅与原始二倍体水稻相似，而且还观察到各种异常小孢子（图5）。在微小细胞发生过程中经常观察到以下五种主要的异常小孢子，如小孢子变性（图5m），两个核仁（图5n，o），多孔（图5p，q），细胞质收缩（图5s）和异常的细胞壁（图5r，t）。

图3台中654 PMC减数分裂过程中的染色体行为。一个合子，染色体凝聚; b粗线期，染色体变得越来越短，双核仁; c diplotene，同源染色体部分分离，黑色箭头显示多种多样，而白色箭头显示单价; d diakinesis，高度浓缩的染色体和箭头显示不同大小的染色体。黑色箭头表示大染色体，白色箭头表示小染色体; e中期I，染色体在赤道排列;后期I，同源染色体开始分离; g末端I，染色体向PMC的两极移动;前期II;在中期II，染色体在每个细胞的赤道处排列; j后期II，染色单体开始分离; k末端II，染色单体向四分体的两极移动; l四分体阶段; m异常中期我显示滞后染色体（箭头）; n异常后期I，显示滞后的染色体（箭头）; o末端异常I，显示滞后染色体（箭头）;在中期II的p异常细胞，显示二元体的不同步，一个在中期II，另一个在后期II;在后期II的异常细胞，显示二元体的不同步，一个在后期II，另一个在末期II;三合会;四分体阶段，显示PMC的异常方向; t tetrad阶段，每个细胞中有双核仁。 91500


我们进行了进一步的分析，以观察后期小孢子阶段的多孔径。结果表明，同源四倍体水稻的多孔径百分比（17.22％）高于二倍体水稻，同源四倍体水稻可以发现双孔径和三孔径（表5）。在同源四倍体水稻的成熟花粉期（22.18％）观察到比二倍体水稻（1.51％）更多的异常小孢子。这些结果与二倍体和同源四倍体水稻的花粉育性一致（表2）。
基于微阵列分析的花粉发育差异表达基因：
Affymetrix GeneChip微阵列用于研究二倍体和同源四倍体水稻在三个花粉发育阶段（减数分裂间期，减数分裂和单个小孢子阶段）中的变化（表1;补充-1图3）。基因显示二倍体和同源四倍体水稻之间超过两倍的上调或下调被分类为“差异表达的基因”。总共有18,111,17,407和17,921个基因在三个花粉发育阶段（包括减数分裂前期间期（PMA），减数分裂（MA）和单个小孢子阶段）显示参照样品（对照，二倍体水稻，台中65-2x）的差异表达。 （SCP），分别。在所有三个阶段中总共表达了16,222个基因。在PMA，MA和SCP中，特定表达基因的比例分别为3.5％，0.7％和5.5％（补充-2图1）。对三个花粉发育阶段的GO分析显示了与分子功能，生物过程和细胞成分相关的差异表达基因的显着分类（补充-2图2-10）。因此，我们可以对二倍体和同源四倍体水稻进行GO比较分析。基于花粉发育阶段计数差异表达基因的数量。结果表明，与二倍体水稻（Taichung65-2x）相比，同源四倍体水稻（台中65-4x）的减数分裂前期间共有778个基因差异表达，其中656个和122个分别上调和下调。 。在减数分裂期间，与二倍体水稻相比，同源四倍体水稻中共有786个基因差异表达，其中661个和125个基因分别上调和下调。在小孢子阶段，294个基因差异表达，其中254个和40个基因分别上调和下调（图6a）。

图4二倍体水稻（Taichung65-2x）花粉发育的细胞学观察。一个Tetrad阶段; b早期小孢子期; c中间小孢子阶段，细胞壁形成开始; d中小孢子期，空泡化;中小孢子期，空泡化;迟到了
小孢子阶段; g晚期小孢子期; h早期双细胞花粉期;中等双细胞花粉期;中间双细胞花粉阶段; k晚期双细胞花粉期; l成熟的花粉阶段。
与二倍体水稻（台中65-2x）相比，在三个花粉发育阶段（减数分裂间期，减数分裂和单小孢子期）中，同源四倍体水稻（台中65-4x）共有1,251个基因差异表达，其中1,011和240个基因分别上调和下调。 Venny软件分析显示在三个发育阶段共有124和6个基因具有调节和共调节表达（图6b，c;补充-3）。
基因本体论（GO）分析
为了在花粉发育过程中注释与二倍体和同源四倍体水稻的遗传变异相关的可能的生物途径，使用AgriGO进行GO功能富集分析。结果显示了
基于分子功能，生物过程和细胞成分的差异表达基因的显着分类。
在同源四倍体水稻前减数分裂间期中共有656个差异上调的基因中，在生物过程中发现了两个显着的功能基因类别。分别发现了与刺激反应（GO：0050896）和细胞氮化合物代谢过程（GO：0034641）相关的6和27个基因。在细胞成分中，发现了一个突出的功能基因类，主要涉及细胞质膜结合的囊泡（GO：0016023），219个基因属于这一类。在分子功能方面，有五个突出的功能基因类别，包括5个与丝氨酸型内肽酶抑制剂活性相关的基因（GO：0004867），7个与转录因子活性相关的基因（GO：0003700），33个与铁离子结合相关的基因（GO： 0005506），27个基因
图4二倍体水稻（Taichung65-2x）花粉发育的细胞学观察。一个Tetrad阶段; b早期小孢子期; c中间小孢子阶段，细胞壁形成开始; d中小孢子期，空泡化;中小孢子期，空泡化;迟到了
小孢子阶段; g晚期小孢子期; h早期双细胞花粉期;中等双细胞花粉期;中间双细胞花粉阶段; k晚期双细胞花粉期; l成熟的花粉阶段。酒吧40 lm
188 Plant Reprod（2014）27：181-196
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与过氧化物酶活性（GO：0004601）相关，发现了与FAD结合相关的9个基因（GO：0050660）（表6）。
在同源四倍体水稻减数分裂的661个差异上调基因中，有两个与花粉发育（GO：0009555）和细胞氮化合物代谢过程（GO：0034641）相关的突出功能基因类别（补充-1图5）。在生物过程中发现了18个基因。五个富含花粉发育的基因（GO：0009555），包括LOC_Os03g07140（Os03g0167600）（其蛋白质类似于雄性不育蛋白2），LOC_Os04g52320（Os04g0613200）（果胶裂解酶折叠/含有毒力因子结构域的蛋白质），LOC_Os09g26780（Os09g0439200）（茉莉酸酯ZIM结构域蛋白7），LOC_Os09g27620（Os09g0449000）（持续性绒毡层细胞1，雄性不育1同源物，热敏核基因雄性不育9-1，含有PHD结构域的蛋白质）和LOC_Os10g25290（Os10g0392400）（茉莉酸酯ZIM结构域蛋白1） ），被发现。在细胞组分中，发现一个突出的类别，总共150个基因涉及细胞质膜结合的囊泡（GO：0016023）（补充-1图6）。关于分子功能，发现了与丝氨酸型内肽酶抑制剂活性（GO：0004867），转录因子活性（GO：0003700），过氧化物酶活性（GO：0004601）和血红素结合（GO：0020037）相关的四个显着功能基因类别。 ，分别由5个，21个，7个和9个基因组成（补充-1图7）。
在减数分裂中的125个下调基因中，在生物过程中发现了一个具有与DNA依赖性DNA复制相关的五个基因的突出功能基因类（GO：0006261）（Supplementary-1 Table S3;图8）。这些基因参与减数分裂过程中的染色体维持。在分子功能中，发现了由DNA结合中的12个基因（GO：0003677）组成的一个突出的功能基因类别（表6;补充-1表S3，图9）。在同源四倍体水稻小孢子期的254个差异上调基因中，在生物过程中发现了一个突出的功能基因类，其中包含19个与刺激反应相关的基因（GO：0050896）。在细胞组分中，发现了一个突出的功能基因类，其中58个基因涉及细胞质膜结合的囊泡（GO：0016023）。在分子功能中，发现了由涉及转录因子活性的五个基因组成的一个突出的功能基因类（GO：0003700），并且基因的总数为11（表6）。
在生物过程中发现了一个突出的功能基因类，在三个花粉发育过程中，240个差异下调基因中有5个与DNA依赖性DNA复制相关的基因（GO：0006261）
阶段（补充-1图10）。在细胞成分中，发现了两个主要参与染色体部分（GO：0044427）和细胞核（GO：0005634）的显着功能基因类别，基因数分别为5和22（补充-1图11）。在分子功能中，发现了与转录因子活性相关的10个基因（GO：0003700）（补充-1图12）。在不同的生长阶段发现了不同的GO;然而，在所有花粉发育阶段都发现细胞成分中的细胞质膜结合囊泡，丝氨酸型内肽酶抑制剂活性和分子功能中的转录因子活性。与两种基因本体相关的基因可能与倍性水平有关。此外，基因集富集（PAGE）的参数分析用于比较三个发展阶段中差异表达的基因。在减数分裂中共发现11个功能基因类别，与其他两个阶段相比具有显着变异，但在其他两个发育阶段没有发现显着的基因类别。 DNA代谢过程（GO：0006259）被认为是由13个基因组成的最重要的基因类，这些基因主要参与DNA复制和染色体配对（Supplementary-1 Fig.4）。
与二倍体和同源四倍体水稻中的花粉发育相关的基因表达谱：
为了表征与花粉发育相关的基因表达，首先分析了与花粉发育有关的基因。我们鉴定了19种与花粉相关的基因，这些基因与减数分裂，花粉育性和花粉识别有关。在减数分裂相关基因中，与减数分裂行为相关的两个基因（Os11g0146800和Os09g0506800）在减数分裂阶段表现出下调。一种花粉不育蛋白OsMS2（Os03g0167600）在减数分裂阶段表现出上调。与花粉识别和花粉发育相关的其他基因显着上调。此外，我们更多地关注在二倍体和同源四倍体水稻中在三个花粉发育阶段连续表达的基因。虽然有少数基因在三个阶段中差异表达，但它主要与倍性水平有关。在差异表达的基因中，130个基因在二倍体和同源四倍体水稻的花粉发育期间上调和下调，其中大多数在减数分裂前期间，减数分裂期和小孢子期期间上调（图7）。这些结果表明，大多数倍性相关基因导致同源四倍体水稻的表达高于二倍体水稻。 GO分类证明，这些基因中的大多数主要涉及对刺激，细胞，转录因子活性，转运蛋白活性和水解酶活性的响应（表7）。
图5同源四倍体水稻（Taichung65-4x）花粉发育的细胞学观察。一个Dyad阶段; b四分体阶段; c早期小孢子阶段; d中小孢子期;小孢子晚期;小孢子晚期; g晚期小孢子期，细胞质桥; h早期双细胞花粉期;我早期的中间双细胞花粉阶段;中间双细胞花粉阶段; k晚期双细胞花粉期; l成熟花粉期; m四阶段异常;中小孢子期异常，两个核仁; o中小孢子期异常，两个核仁，细胞质异常，细胞形态; p，q双孔径和异常细胞形状; r异常细胞壁;厚厚的细胞质;小孢子晚期，小孢子异常形状。
通过定量RT-PCR确认微阵列结果：
为了确定二倍体和同源四倍体水稻中差异表达的基因，选择了12个基因
在三个花粉发育阶段的qRT-PCR分析（补充-1表S4）。选择以下代表性基因进行分析，包括4个参与花粉发育的基因，2个与转运蛋白活性相关的基因，4个基因在3个发育阶段（PMA，MA和SCP）稳定上调和下调，以及2个基因在上述阶段表现出上调和下调的差异。基于qRT-PCR分析，8个基因（Os09g0563200，Os11g0146800，Os09g0506800，Os06g0265400，Os03g0800200，Os07g0583600，Os06g0128300和Os01g0501800）描述了与qRT-PCR和微阵列分析相似的模式（图8），而少数基因显示不同基因表达趋势与qRT-PCR和微阵列分析。例如，在微阵列和qRT-PCR分析期间，Os06g0683100在PMA和SCP处显示相似的表达，但在qRT-PCR中该基因的表达在MA处降低。总之，qRT-PCR产生的12个基因的表达与微阵列分析一致，证明了微阵列结果的可靠性和准确性。

图6二倍体和同源四倍体水稻花粉发育过程中差异表达基因的鉴定。 a每个阶段的差异表达基因。横轴上的字符代表三个花粉发育阶段，包括减数分裂间期（PMA），减数分裂（MA）和单个小孢子阶段（SCP），垂直轴显示上调和下调基因的数量。 b上调基因表达的维恩图在premeiotic，减数分裂和小孢子阶段重叠。数字表示具有显着性测试的基因（P <0.05）。 c下调基因表达的维恩图在减数分裂前，减数分裂和小孢子阶段重叠。数字表示具有显着性测试的基因（P <0.05）

讨论：
对同源多倍体的研究可以更好地理解染色体加倍对基因组稳定性的影响。与其相应的二倍体相比，自体多倍体显示出更大的细胞，更大的器官和更多的营养;这可能是由于染色体加倍。许多科学家已经证明了与其相应的二倍体相比，与大的形态差异相关的同源多倍化的影响（Stupar等人2007; Allario等人2011; Aversano等人2013; Shahid等人2013a）。尽管在形态学和细胞学水平上倍性水平明显改变，但倍性水平改变的影响仍不清楚（Riddle等人2010; Tsukaya 2008）。在本研究中，我们进行了二倍体和同源四倍体水稻之间的表型分析，以更好地了解染色体剂量对基因组稳定性的影响。结果表明，与二倍体水稻相比，大多数表型图表显示出同源四倍体的显着差异，并且籽粒和叶片形态图表都显示出很大的变异。一般来说，这些结果与同源四倍体水稻的先前发现一致，后者证明大同胚和高生物量产量是同源四倍体水稻与其原始二倍体水稻相比的显着特征（Song and Zhang 1992; Shahid et al.2011） 。在植物生长中，功能性花粉的产生对植物繁殖和遗传多样性至关重要。花药发育和小孢子发生阶段的时间受到严格调控，其特征是从花粉分裂初期细胞分化到花粉形成，成熟和花药开裂期间释放的特异性现象（Goldberg等，1993; Sanders等，1999; Scott）等人，2004; Ma2005; Borg等，2009）。在最近的一项研究中，花粉育性与减数分裂中的染色体行为有关（He et al.2011a）。这些作者还报道了同源四倍体中异常染色体行为的频率高于二倍体水稻。在这项研究中，与台中65-2x相比，台中65-4x的花粉育性发现了非常显着的变异。对于染色体行为，在减数分裂期间观察到染色体分散，异常位置和未分离的多价，尤其是在中期I，后期I，中期II和后期II中。此外，与台中65-2x相比，Taichung65-4x在染色体构型上显示出显着差异，并且在Taichung65-4x中发现了比台中65-2x更高的多价和单价频率。这些结果与先前的研究一致，他们发现同源四倍体水稻的染色体构型发生了明显的变异，而不是二倍体对位（He et al.2011b）。
微生物发生是花粉发育过程中的另一个重要过程。由于细胞壁较厚，细胞质浓度较高，因此在同源四倍体水稻体内通过显微镜观察小孢子的细胞核和细胞质是很困难的。因此，我们首先使用共聚焦激光扫描显微镜（WE-CLSM）的曙红B染色程序来观察体内微小的发生。从这项研究中，在台中65-4x中发现了许多异常，包括退化的小孢子，细胞质和细胞壁异常。同源四倍体水稻微瘤发生过程为
类似于原始的二倍体大米和类似的分裂时间被发现。这些结果与Feng等人一致。 （2001），他们也发现了二倍体和同源四倍体水稻之间相似的微球形成。然而，在微球体发生过程中，在同源四倍体水稻中观察到小孢子的许多差异，例如小孢子变性，两个核仁，多孔径，细胞质收缩和异常细胞壁。值得注意的是，在成熟花粉阶段观察到的异常小孢子在二倍体和同源四倍体水稻之间显示出非常相似的花粉育性。这些结果表明，在微球体发生过程中异常的染色体行为和异常导致同源四倍体水稻的低繁殖力。


图8二倍体和同源四倍体水稻在三个花粉发育阶段（PMA，MA和SCP）中基因表达谱的定量实时PCR确认。 a，b，c，d，f，g，j，l显示微阵列和微阵列之间几乎相同的基因表达模式
减数分裂间期（PMA），减数分裂（MA）和单小孢子期（SCP）期间的qRT-PCR; e，h，i显示了MA基因表达模式的差异; k显示PMA和MA的基因表达的不同趋势

已经报道了几种物种中的四倍体微阵列分析，例如马铃薯（Solanum phureja）（Stupar等人，2007），玉米（Zea mays）（Riddle等人，2010），朗布尔石灰（Citrus limonia）（Allario等人， 2011）和拟南芥（Yu et al.2010; Li et al.2012）。使用微阵列分析对同源四倍体拟南芥的研究表明，基因表达是稳定的，非随机的，并且在发育上具有特异性。同样，Allario等人。 （2011）在朗布尔石灰中进行了基因表达研究，发现与水分缺乏有关的6个基因中有5个显示出二倍体和同源四倍体水稻之间的差异。马铃薯的遗传分析和转录组学研究为多倍体效应打开了大门。马铃薯和拟南芥中的转录组学实验使用了9,000个基因和超过40,000个基因的微阵列揭示了它们之间的关系
倍性和基因表达水平的改变（Stupar等人2007; Yu等人2010）。这些发现意味着微阵列分析可用于研究二倍体和自体多倍体的倍性效应和表型改变。在我们之前的研究中，台中65-2x和Taichung65-4x的DNA水平SSR标记显示差异不大（Wu et al.2013）。我们推测二倍体和同源四倍体水稻的基因表达差异可能是花粉发育过程中高度变异的原因。因此，研究二倍体和同源多倍体的全基因组表达模式将是有趣的。
为了探索在花粉发育过程中导致同源四倍体水稻高度变异的关键基础分子开关，在当前的工作中分析了二倍体和同源四倍体水稻的全基因组基因表达谱。据我们所知，本研究是在花粉发育过程中进行同源四倍体水稻基因表达变异的第一次尝试。分子研究已经确定了许多在花粉发育过程中表达的基因（Ma，2005）。基于基因表达模式，至少130个基因在花粉发育期间表现出稳定的表达。在分析了花粉发育过程中二倍体和同源四倍体水稻基因表达的这些差异后，发现了鉴定基因中的一个广泛的功能类别。例如，与二倍体水稻相比，同源四倍体水稻中与花粉发育相关的三种基因DMC1（Os11g0146800），OsMS2（Os03g0167600），PAIR2（Os09g0506800）差异表达。 DMC1和PAIR2是减数分裂相关基因，已经在水稻中进行了实验证实（Deng和Wang 2007; Nonomura等人2006; Aya等人2011），OsMS2是一种雄性不育蛋白，与绒毡层变性和异常小孢子有关。花药（Li et al.2011）。减数分裂和雄性生育相关基因在花粉育性中起着重要作用。在本研究中，PAIR2基因在减数分裂阶段下调，但在减数分裂前和单个小孢子阶段没有发现表达差异。这些结果与先前关于其他多倍体的结果一致，后者证明ASY1（PAIR2的同源基因）在多倍体中表现出差异表达，并且它可能在促进同种异体和同源多倍体中的减数分裂稳定性中起重要作用（Boden等。 2009; Hollister等人2012; Yant等人2013）。除PAIR2外，DMC1和OsMS2基因分别在减数分裂前和减数分裂阶段上调。此外，一个与持久性绒毡层细胞和雄性不育相关的基因（Os09g0449000）和与DNA依赖性DNA复制相关的五个基因（参与染色体维持和配对）分别在减数分裂中被检测到上调和下调。这些差异表达的基因可能在花粉发育过程中影响正常的染色体突触和重组。本研究还发现，许多稳定的上调和下调基因参与细胞代谢，细胞过程，生理过程，对刺激的反应，发育过程，繁殖和定位。例如，两种结合蛋白，凝集素蛋白激酶家族蛋白（Os03g0838100）和赤霉素反应调节蛋白（Os07g0583600）分别在三个发育阶段显示稳定的上调和下调基因表达。通常，这些差异表达的基因在花粉中
同源四倍体水稻的发育水平不仅与花粉发育相关的基因有关，而且还与全细胞过程基因有关。从这些结果，我们还推测差异表达的基因导致同源四倍体水稻重复后基因网络的变化。有趣的是，在花粉发育过程中，在二倍体和同源四倍体水稻中发现了两个相关途径。一个是在稳定表达的上调基因和另一个细胞周期相关途径中发现的生物刺激的反应，在下调基因中表达。二倍体和同源四倍体水稻中这些矛盾的基因表达模式可以解释同源四倍体比二倍体水稻更高变异的原因，并且需要进一步研究。总之，我们的结果强烈支持二倍体和同源四倍体水稻的改变导致花粉发育中的高遗传变异的影响。此外，这项工作表明，花粉发育的变化不仅涉及花粉发育基因，还涉及其他全细胞基因。在这些结果的基础上，我们推测同源四倍体水稻的差异基因表达水平和改变的基因网络扰乱了染色体行为和微小的发生，从而导致同源四倍体水稻的花粉育性低。
致谢作者感谢张桂泉教授捐赠台中-65的支持。我们还要感谢莫敦洲先生，赵兴娟女士和于淑红的技术援助。这项工作得到了国家自然科学基金委员会（31270352和31210103023到XD刘），广东省重点大学平台和重大科研项目（自然科学） - 特色创新项目[Yue-JK2014（65）to XD Liu]和广东省的支持。亚热带农业生产资源保护与利用国家重点实验室科技专项基金（2012年）。
感兴趣的冲突作者声明没有利益冲突。