正负筛选（neo正向+HSV-tk负向）原理

正负筛选的发展（用途）

正负选择系统是基因打靶的常用筛选方法之一。为了更好地筛选发生同源重组的克隆，1988年Mansour等人设计了正负双向选择系统(positive-negative-selection PNS), 解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。

正负筛选原理

• 同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内****，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因。

• 在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC，也称为鸟嘌呤）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418和 GANC都有抗性。

• 随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死
  无整合的时候将被G418杀死。

用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因
Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。除了上述方法外，还可用PCR及Southern杂交法进一步筛选及鉴定中靶细胞