基于高通量表型的QTL定位揭示了甘蓝型油菜耐盐胁迫的遗传结构

基于高通量表型的QTL定位揭示了甘蓝型油菜耐盐胁迫的遗传结构

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摘要：
对3种不同盐胁迫条件下的自然群体和9种不同胁迫条件下的品种间代换系群体的2111个基于图像的性状（i ‐ traits）进行了定量分析，以监测和评价油菜的耐盐性。最终鉴定出928个与甘蓝型油菜耐盐性相关的优质I-性状。此外，我们通过GWAS绘制了自然群体中与盐胁迫相关的基因座，并分别进行了与ISL群体相关的连锁分析。结果表明，筛选出234个与盐胁迫应答相关的候选基因，其中2个新的候选基因BnCKX5和BnERF3被实验证实与调控甜菜的盐胁迫耐受性有关。

• 耐盐系数(STC)=不同时间点盐胁迫条件(T)/正常条件(CK)
• 盐浓度(%)=W1(NaCl含量)/W2(土壤干重)
• （R_max）：重复间的相关系数
• (PH)plant height ,(AFB)aboveground fresh weight , (ADB)aboveground dry weight , (LA)leaf
  area , (Stem_DW)stem dry weight , (Stem_FW)stem fresh weight ,(SPAD)chlorophyll content ,

1. 介绍

• 从505份自然群体和91份(ISL)中提取了54个侧向(CS)衍生性状、17个顶向(DS)衍生RGB衍生性状和2040个高光谱衍生性状（I-traits）。
• 通过基于I-性状的GWAS和连锁分析，鉴定并比较了与耐盐性相关的QTLs。预测了234个与盐胁迫反应相关的候选基因，其中BNCKX5和BNERF3分别位于CHRA02和CHRA06上，进一步对候选基因的耐盐性功能验证。
• 通过505份自然群体和91份ISL群体的原始图像、基因型和表型数据的GWAS和连锁分析，对甘蓝型油菜的盐胁迫反应进行了评价。

2. 实验材料与方法

2.1 材料：

• 505份自然群体和91份ISL群体

2.2 逆境处理与高通量表型分析

• 505份自然群体：
  
• 505份ISL群体：
  
  盐浓度（%）= W1（NACL含量）/W2（土壤干重）

2.3 高通量表型图像分析与性状提取*（Visual Studio 2015（Microsoft）和OpenCV 3.4）*

• (CS-RGB)图像的处理：

（1）用一个预定义的矩形块从原始侧视(CS)图像中去除传送带和其他杂质，得到裁剪后的图像；

（2）将RGB图像转换为HSI彩色模式进行分割。 三个阈值分别应用于三个平面。 色相平面的0-141，饱和度平面的38-255，强度平面的41-255的数值用步骤1代替。 然后利用分割后的二值图像计算形态学相关特征；

（3）利用第二步二值图像处理得到的图像凸壳，计算出
其他形态学相关特征。

（4）采用二值图像作为图像的掩模对步骤1得到的灰度通道的RGB图像和相应的灰度图像进行处理，然后从这些图像中计算出颜色相关特征和直方图纹理相关特征；

（5）最终生成20个CS图像，并获得每个样本的I-性状。

• （DS-RGB）图像的处理

（1）使用预先定义的矩形块去除原始DS图像中的传送带等杂质，得到裁剪后的图像;

（2）采用过绿（E × G）分割方法从原始DS-衍生的RGB图像中获得分割的二值图像，然后计算形态学相关特征;

（3）将二值图像作为原始DS图像的模板，计算处理后的RGB图像、灰度通道的灰度图像、绿色通道的灰度图像等的直方图纹理特征和颜色相关特征。

• (GGP-RGB)处理

（1）从HSI成像系统获得一个样本的二进制数据流，并且最终重组这些二进制数据流以获得250个GGP图像（支持信息：表S3）;

（2）从这250个GGP图像中选择两个进行分割以获得新的灰度图像。然后对灰度图像进行分割，得到新的二值图像，并对二值图像进行处理;

（3）使用步骤2中的二值图像对250张GGP图像进行掩模，随后对这些图像进行处理以计算光谱特性，包括全反射率相关特性、平均反射率相关特性和对数相关特性。

2.4 人工测量形状

• 
• 其中包括了叶片叶绿素，脯氨酸，丙二醛，相对电导率

2.5 盐胁迫反应相关性状的高重复性、高遗传力和显著处理效应的测定

为了选择具有高重复性、高遗传力和显着处理效果并与盐胁迫反应相关的性状，
开发出了算法：离群点检测、计算重复间的相关系数（R_max）强弱、动态遗传力分析、计算方差分量（包括遗传效应、处理效应、遗传效应与处理效应的互作效应）、最终筛选出了928个优质i_traits）

2.6 I-性状与传统农业性状的相关网络

为了将高通量表型测定的性状与传统的农艺性状和生理性状联系起来，对这些性状进行了破坏性测定，并进行了相关分析构建了一个包含不同生育期和胁迫条件的大相关网络(Pearson相关系数®≥0.3,P<0.001)。 利用GEPHI对相关网络进行了可视化.

2.7 GWAS与连锁分析

• 对505份自然群体，GWAS分析鉴定到657,136个显著的SNPs，人工测量性状鉴定到5,531个与盐胁迫响应相关的显著SNPs，GGP图像指标鉴定到283,227个与盐胁迫响应相关的SNPs；
• 对91个ISL群体进行连锁分析，GBS测序。

2.8 候选基因的功能研究

为了验证候选基因在盐胁迫下的功能，从X182(97097)中克隆BNAA02G05340D(BNCKX5)和BNAA06G02670D(BNERF3)的编码DNA序列，然后用KpNI和XBAI限制性内切酶消化PCR片段，用连接酶连接到pCambia-1300S载体上，用Westar（WT）作为转基因受体材料。

3 结果

3.1 高通量表型分析油菜胁迫条件

505份自然群体

• 在T1-T5（T1-T3时期收集RGB和GGP图像，T4-T5时期收集RGB图像）的5个时间点，我们总共收集了454500张CS衍生的RGB图像、22725张DS衍生的RGB图像和13635张GGP图像。

91个ISL群体

• 在T1-T5的5个时间点，共收集了245700张CS衍生的RGB图像和12285张DS衍生的RGB图像。

人工测量形状

提取I-性状

从505份自然群体和91份ISL群体提取54幅RGB衍生I-性状的CS图像（支持信息：表S4)和17幅RGB衍生I-性状的DS图像（图 1c；支持信息表S5)；2040个GGP I-性状,共2111张I-traits

• 为了评价表型平台的性能，对20份随机种质进行生长和测量，以评价高通量表型平台的测量和性能，并通过破坏性抽样和高通量表型平台的无损测量，包括CS RGB衍生测量、DS RGB衍生测量、GGP测量和传统农业和生理性状的人工测量，构建了一个可靠和稳健的模型，以评估和预测三种盐胁迫条件下五个时间点的植物传统农业性状。

• 总共评估并进一步分析了8792个原始I-性状，包括432个CS RGB衍生性状、136个DS RGB衍生性状、8160个高光谱衍生(GGP)I-性状和64个传统衍生（破坏性获得）性状（图1c)(Guo et al.，2018)。
  

3.2在盐胁迫下确定与盐胁迫反应相关的高重复性、高遗传力和显著处理效果的可靠I-性状

• 为了量化数据，基于阈值的过滤程序（中位数±3SDS)创建了一系列过滤条件，并评估了三个生物复制之间的重复性。 重复性的过滤标准是中值相关系数大于0.5(R_max≥0.5)，选出CK、LY、HY处理下的CS、RGB、GGP(包括所涉及的GGP_marker)衍生性状。 这些I-性状在所有3个重复中显示出高度的重复性（除去异常值后）（图2a)。 通过描述性统计、动态热图和盐胁迫响应的聚类图趋势，表明了在盐胁迫下的动态变化和变异（图1a-d；
  
• 计算和分析了505份材料和91份ISL在盐胁迫下的广义遗传力(H2B)随时间的动态变化。 约64%的I-性状H2B值大于0.5
  
• 将高遗传力中位数(H2B≥0.5)和低盐处理效应显著相结合，获得了1141个（54.05%）性状;同时，我们获得了1287个（60.97%）具有高遗传力和高盐处理效应的性状。从三个重复间的稳定性来看，我们综合了动态R_max中值和低处理效应，最终筛选出1801个性状（85.32%）。 对于动态中值R_MAX 和高处理效应，共选择了1976个性状。
  
• 最后，通过严格的筛选标准，我们获得了928个与盐胁迫反应相关的性状。
  

3.3 I-性状作为盐胁迫生物标记预测传统性状

• 为了预测传统的农艺性状，包括株高(PH)、地上鲜重(AFB)、地上干
  重(ADB)、叶面积(LA)、茎干重(STEM_DW)、茎干鲜重(STEM_FW)和叶绿素含量(SPAD),开发了一系列涉及模型构建的非破坏性方法；从预测结果来看，经逐步回归分析和五重交叉验证，大部分预测指标的调整决定系数(R2)均大于0.8：

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利用预测模型，我们预测了随着时间的推移ADB、AFB和pH值,这些结果表明，我们建立的基于I-性状的预测模型可用于盐胁迫下甘蓝型油菜农艺性状的预测。

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3.4 甘蓝型油菜遗传基础解析

• 505份自然群体，我们通过与FAST-LMM和Gemma的线性混合模型进行了246个STCs的GWAS，其中包括324个CS RGB衍生性状、102个DS RGB衍生性状、756个高光谱衍生(GGP)性状和4个人工测量性状
• 对于91个ISL群体，利用ICI-mapping构建了盐胁迫相关QTLs，通过连锁分析，在不同时间点和不同盐胁迫条件下涉及2132个RGB衍生性状的耐性系数；
• 共鉴定了657,136个重要的SNP。其中确定了5531个与盐胁迫反应相关的人工测量性状的显著SNP；还发现了3227个与GGP性状显著相关的SNPs。在人工测量的5531个显著的SNPs中共有1197个显著的SNPs与I-性状相关的显著SNPs共定位。 评估了盐胁迫反应相关的显著SNP的影响，其与随机SNP的影响显著不同（图3b）。具有共定位SNP频率的性状数量显示了染色体上不同的热点区域和分布区域（图3c）。为了避免可能的假阳性显著SNP，将与盐胁迫反应相关的可靠SNP定义为具有10个以上共定位SNP（以频率计）的SNP，这些SNP在染色体上呈现不同的数量（图3d;支持信息：表S12）。量化了在人工测量性状和i ‐性状之间共享共定位SNP的性状。几乎一半的人工测量性状显示了高频SNP与50多个i-性状的共定位，如脯氨酸浓度、ADB、相对电导率（REC）和产量（图3e;支持信息：表S12）
  
• 我们最终聚焦于234个与盐胁迫反应相关的候选基因中，在CS RGB衍生性状、DS RGB衍生性状、高光谱衍生(GGP)性状和人工测量性状之间检测到的2814个高频和共定位SNPs。了（包括CS 、DS RGB性状，GGP性状和人工测量性状在内的）2814个高频和共定位SNP；SnRK2、RD20、SOS3、ABI5和WRKY33等许多先前报道的与盐胁迫反应相关的基因在QTL定位中被发现，它们在野生型WT植物和盐胁迫植物之间差异表达。
  
• 对91个ISL的连锁分析，我们确定了204个分布在不同染色体上的显著和高频共定位QTL。

3.5 BNCKX5过表达增加对盐胁迫的敏感性

• 通过GWAS在CHRA02上检测到许多不同类型性状的重要共定位SNPs我们检测到57个高频共定位的SNP,包括4个位于CHRA02上的SNP簇（簇I为2 062 941至2 518 619 bp；簇II为2 753745至3 206 647 bp；簇Ⅲ为11 141 835至11 142 240 bp；簇Ⅳ为23011 682从2 062 941到24 168 754 bp；在CHRA02上检测到许多不
  同类型性状的重要共定位SNPs:ADB_HDCK和SPAD_LDCK（人工测量性状）； GPA_SV_CS5_HDCK和HA_SV_CS5_HDCK（RGB性状）； 以及DA234_GGP2_HDCK、M4_HDCK_GGP3和M20_HDCK_GGP3(GGP特性）

• 在CHRA02簇I中，基于两两连锁不平衡(LD)相关关系(R2>0.5), 在引物SNPBNVAA0202316797上下游200kb内约有50个基因与ADB相关（图 4a,b）。BNAA02G05340在盐胁迫和ABA处理下得到高度诱导（图 4c），并含有导致氨基酸变化的SNP变异（图 4d；BNAA02G05340命名为BNCKX5;其单倍型分为单倍型A、B、C（图 4e–i），单倍型分析： 单倍型C的ADB在控制、低和高盐胁迫显著高于单倍型A和单倍型B下（图 4e–g）。单倍型A在(ADB_LDCK)条件下的比值范围与单倍型B和单倍型C之间差异显著，但与单倍型B和单倍型C之间差异不显著（图 4h）。 此外，在ABD方面，高盐胁迫下与对照条件下的单倍型B比值(ADB_HDCK)的范围小于单倍型A比值（图 4i）。 总之，这些结果表明，大约30个单倍型C型材料可能是抗盐胁迫种质资源，是育种家的宝贵资源

• 从X182(97097)中克隆BNAA02G05340D(BNCKX5)和BNAA06G02670D(BNERF3)的编码DNA序列，然后用KpNI和XBAI限制性内切酶消化PCR片段，用连接酶连接到pCambia-1300S载体上（支持信息：表S16)。 克隆引物和测序引物来自青岛生物技术武汉有限公司。 用Westar作为转基因受体材料。将 BnCKX5转基因至WT植物中，对其基因表达量进行分析
  CS的最小边界盒高度(H_sv)（图4s)、CS的绿色投影面积(GPA_sv)（图4t)和CS的总投影面积(TPA_sv)；

3.6 BNERF3过表达提高抗盐胁迫能力

• 我们通过不同类型的GWASS获得了36个高频共定位SNPs，在CHRA06上分为3个簇（簇I为1 695 085至2 163 217 bp；簇II为3 062 521至6618 806 bp；簇Ⅲ为18 159 306至21 636 994 bp）。通过我们的GWAS研究了一系列不同类型的性状，如ADB_HDCK和REC_LDCK（人工测量性状） ,HWR_TV_DS2_HDCK,FN_SV_LDCK_CS5（ RGB 性状）,DT204_GGP3_LDCK和M35_LDCK_GGP2（高光谱来源性状）,在CHRA06上发现了许多重要的共定位SNPs（图）3g； 另外，U_tex_sv_cs4_ly标记A06_m2(LOD=26.57)和MU3_tex_tv_hylj标记A06_m2(LOD=10.97)之间的QTLs峰共定位于CHRA06（图S10B)上。 在CHRA06簇I中，基于两两LD相关(R2>0.5)，在与ADB相关的前导SNPs BNVAA0601558949和BNVAA0601662590上下游200 kb内约有40个候选基因（图5a，b)。 BNAA06G02670D在盐胁迫和ABA处理下被高度诱导（图5C)，它含有导致氨基酸变化的SNPs（图5D；支持信息：表S14)。 BNAA06G02670D命名为BNERF3，编码ERF/AP2转录因子； 然而，该蛋白是否在植物耐盐胁迫中起作用尚不清楚（Z.Zhang&Huang,2010）。 ERF家族基因在拟南芥、水稻、甘蓝型油菜、番茄等植物中的过度表达已被证实可以提高对许多非生物胁迫的耐受性（Aharoni et al.，2004；Song et al.，2005)。

• 单倍型分析：单倍型B和单倍型C的505份材料的ADB值显著高于单倍型A和单倍型D，且单倍型D的ADB值在对照、低盐胁迫和高盐胁迫下的4个单倍体类型中最低（图5E-G)。 单倍型CADB(ADB_LDCK和ADB_HDCK)比值范围大于其他单倍型（图5H，I)。 无论实际ADB值和处理条件与对照条件的比值如何，单倍型B和单倍型C的范围都低于其他两种。 结果表明，单倍型C和单倍型D可能是敏感品种，包括25个品种；单倍型B可能是耐盐品种，包括10个品种； 这些材料对育种家来说可能是丰富的种质资源（支持信息：表S14)。
  

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4 讨论

• 首次使用了一个高通量的表型平台，包括RGB衍生的和特别是GGP衍生的标记，以GWAS和连锁分析为基础来揭示盐胁迫反应。
• HeatMap和聚类趋势图分析表明，与RGB衍生性状相比，大多数高光谱衍生性状强烈地反映了甘蓝型油菜的盐胁迫反应（支持信息：图S1)。
• 通过GGP成像，我们发现LGT1～LGT20和LGT150～LGT250等一系列不同波长范围与ADB相关。 CS RGB衍生的SE_tex_sv、S_tex_sv和GPA_sv与pH值呈极显著相关。
• 氯荧光成像可用于检测对盐胁迫响应的早期和晚期变化（Awlia等， 2016； 葛等人、2016）。
• 叶绿素含量被认为是胁迫的关键因素，并与DDT122和LGA120～LGA130等GGP型性状密切相关。
• 产量性状是重要的，我们发现CS RGB衍生的U_tex_sv、E_tex_sv、Tpa_sv和FDnic_sv以及DS RGB衍生的M_tex_tv、U_tex_tv、E_tex_tv和GPa_tv与产量指标密切相关。 这些不同类型的性状可以作为反映盐胁迫反应的指标。
• 构建了一个稳健的预测模型（支持信息：图S3-S5)，该模型可用于通过高通量表型平台预测与盐胁迫 反应相关的传统测量、动态测量和破坏性测量性状，以促进耐盐油菜的育种。
• 通过单倍型分析、序列变异分析、RNA测序(RNA-SEQ)、遗传转化和盐胁迫下的功能验证，
• 基于高通量表型的GWASS能有效地识别与盐胁迫反应相关的基因或QTL，具有更多的主效和微观效应，填补了关于甘蓝型油菜盐胁迫反应的研究空白。

5 结论

• 本研究揭示了一种新的和可靠的方法来解决与甘蓝型油菜盐胁迫反应相关的复杂农艺性状。

• 一些基因或QTL可能是假阳性。 本研究仅鉴定出两个基因，不足以揭示甘蓝型油菜耐盐胁迫的机理。需要验证更多与盐胁迫反应相关的候选基因。 因此，将多视角数据与高通量表型平台、GWASS和连锁分析相结合，为研究甘蓝型油菜的遗传和分子机制提供新的途径。

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