植物纳米探测器简介 | 综述（Nanobiotechnology approaches for engineering smart plant sensors）

本文主要摘自综述文章：Nanobiotechnology approaches for engineering
smart plant sensors，JP Giraldo, H Wu, GM Newkirk, S Kruss，Nature nanotechnology，2019，https://doi.org/10.1038/s41565-019-0470-6，简要介绍了纳米探测器的类型、原理
、应用和局限。

概述

生物纳米探测器是一种用于检测生物体内化学信号的纳米级探测器。探测器本质上是一种信号转化器，将难以检测的化学信号（如物质浓度）转化为容易检测的物理信号（如光信号）。目前探测器只能对信号进行转化，而信号的加工、汇总则需要依赖于接收器。虽然文章展望了纳米探测器在大田农业中的美好前景，但以目前的技术水平来看，纳米探测器 仅支持探测器在实验室科学研究中使用，想要在大田中推广还需要攻克诸多难题。

优势

生物纳米探测器主要优势如下：

1. 无损、实时监测特定分子的含量。可以完整掌握特定生理过程的动态变化规律。
2. 相比代谢组，探测器可以捕捉到短暂、易降解、低含量的生理代谢物。
3. 外部表型变化是内在生理变化积累的结果，直接监测内在的生物分子含量可以更快的评估植株的健康状况，及早得改变生长环境，提高作物产量，降低生产成本。

下面分类介绍三种研究较多的生物纳米探测器：基因编码探测器、纳米材料探测器、穿戴式纳米探测器。

1. 基因编码探测器

1）原理

基因编码探测器是一种 蛋白复合体，主要用于检测 生物体内物质 的含量。探测器一般分为 结合区 和 荧光区。结合区蛋白特异性识别靶物质（待分析物），并在与靶物质结合后改变构象，使荧光区蛋白的发光波长、强度等发生改变。研究人员可以通过探测器发光波长、强度的改变推断出生物体内待分析物（靶物质）的含量变化。

目前主要通过 FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，荧光共振能量转移）和 cpYEF（Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein，环状黄色荧光蛋白）两种方式来检测靶物质的含量。

FRET 是指当供体荧光分子的荧光光谱与受体荧光分子的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能 诱发受体分子发出荧光，同时 供体荧光分子自身的荧光强度衰减 的现象，即 光谱曲线发生偏移。FRET 的强度随供、受体分子间的距离增加而显著减弱。如下图所示，结合区蛋白与靶物质结合导致构象改变，大幅缩短了 CFP（Cyan Fluorescent Protein，青色荧光蛋白）和 YFP（Yellow Fluorescent Protein，黄色荧光蛋白）间距离，使荧光蛋白间可以发生 FRET。根据 YFP 的发射光光强，判断靶物质的含量。

cpYFP 是一种特定检测超氧阴离子自由基的指示剂，可以在被 405nm、488nm 波长的光激发（excitation）后在 530nm 波长处产生发射光（emission）。cpYFP 与 H₂O₂ 反应后会形成 -S-S-，二硫键的形成使蛋白对不同激发光的响应出现差异：在相同的光照强度下，488nm 激发光在 530nm 处产生的发射光（$F488$）更强。根据 $F488/F405$ 的比值可以得到 cpYFP 中二硫键的含量，进而推断出 H₂O₂ 的含量。

2）导入

目前，将包含编码生物纳米探测器基因的质粒导入到植物体内可以通过碳纳米管（carbon nanotubes，CNT）、介孔二氧化硅纳米粒（mesoporous silica nanoparticles，MSN）、磁性纳米粒等材料。

3）应用

GCaMP3 是一种 Ca⁺ 含量探测器，对细胞内钙离子含量敏感，荧光强度与钙离子浓度成正比。下图展示了拟南芥受到机械损伤（如食草动物啃咬）后的细胞内钙离子浓度随时间先升高后降低，其中叶脉处的钙离子浓度显著提高。

Hyper2 是一种基于 cpYFP 改造而成的 H₂O₂ 含量探测器，$F488/F405$ 的比值与 H₂O₂ 浓度成正比。下图反映了烟草叶片在强光（High Light，HL）照射下 H₂O₂ 的含量变化。Merged 展示了细胞核（绿色）和叶绿体（红色）的位置，F488/405 nm 展示了细胞内 H₂O₂ 含量。前两幅图是叶片在黑暗环境下拍摄得到，后两幅图是叶片暴露在强光下 60min 后拍摄得到。可以发现，光照会显著提高细胞核和质体内 H₂O₂ 含量。

4）局限

1. 探测器难以设计。探测器的设计既需要保证结合区蛋白与 特异性 底物反应，又需要保证结合区、发光区的反应是 可逆 的。同时，基因能够在生物体内 长期、稳定、正确 的被转录和翻译，不能被生物体所降解。所以探测器的设计极为 复杂、费时。
2. 探测器难以推广。检测不同的物质需要设计不同的探测器。由于不同生物的细胞内环境不同，使探测器在导入、稳定、表达等方面存在差异。目前的实验结果表明，同一探测器在不同物种之间的有效性差异较大。由于叶绿体基因在不同植物中较为保守，叶绿体内环境较为稳定，所以研究人员希望探测器能够在叶绿体中被稳定表达，但 将编码探测器的基因精准定位到叶绿体中仍存在诸多挑战。
3. 探测器难以同时测定多种物质的含量变化。探测器将化学信号转化为 光信号，若要检测多种物质的含量则需要各探测器的荧光波长之间存在一定的差异。目前 荧光蛋白种类有限，多种物质同时检测存在挑战。
4. 探测器是否健康仍未被证明。探测器稳定存在于生物体内，其对生物生长的影响，对食用作物后 人类健康 的影响等问题仍需要实验和时间来验证。
5. 探测器难以应用在大田实验中。目前探测器荧光的测定都是在暗室中完成，在大田中强烈的太阳光会覆盖叶片中探测器的微弱荧光，使此类探测器目前仅适用于实验室内的科学研究。

2. 纳米材料探测器

1）原理

纳米材料探测器使用可以 发射荧光 的纳米材料作为基础，在材料表面添加可以与待分析物 特异性结合的涂层，待分析物与涂层的结合会 降低纳米材料的发射光强，根据光强的降低幅度，可以推算出待分析物的浓度变化，如下图所示。由于纳米材料探测器不具有生物元件，所以没有定位功能，在生物体内以自由扩散的形式运动。目前常用的纳米材料探测器主要是 SWCNT（Single-walled carbon nanotubes，单壁碳纳米管）和 QD（Quantum dots，量子点纳米材料），其中 SWCNT 发射荧光的波长处于 近红外区（nIR）。

2）导入

目前主要是两种将纳米材料探测器导入植物组织内的方法：无针注射法（通过瞬时高速、高压喷射流将注射器内物质射入组织中）、真空渗透法（将植株完全浸入含探测器的液体中，对容器抽真空至植株有气泡析出，迅速放气，完成探测器的注入）。

3）应用

下图展示了 SWCNT 在拟南芥叶片中对 H₂O₂ 含量的监测。

4）局限

纳米材料探测器通过涂层实现与底物的特异性结合，找到特异性强、与底物可以可逆结合的涂层是此类探测器研发的难点。为了探测器具有靶向性，如何将多肽等有活性的生物分子与纳米材料有效结合也是未来的研究方向之一。总体来说，纳米材料探测器与基因编码探测器的局限相似。

3. 穿戴式纳米探测器

1）原理

相比于前面两种探测器，穿戴式纳米探测器 附着于植物表面，主要用于监测植物产生的重要的 挥发性分子，如乙烯。穿戴式纳米探测器与纳米材料探测器一样不具有生物元件。目前穿戴式纳米探测器主要以 SWCNT 为基础设计而成，具有良好的柔韧性。待测分子与 SWCNT 特异性结合，进而改变 SWCNT 的电阻值，通过 测定电阻值变化幅度，估算出待测分子的浓度。

2）应用

SWCNT-Cu 复合物 可以用于检测 乙烯 含量。SWCNT 上的铜离子与乙烯分子可逆结合，从 SWCNT-Cu 1 形态转化为 SWCNT-Cu 2 形态，同时 SWCNT-Cu 的导电性降低。实验中常用 万用表 测量 SWCNT-Cu 的电阻变化量（ $△G/G_0$ ）来推断出乙烯的浓度。下图展示了 SWCNT-Cu 的原理图及不同乙烯浓度下探测器的电阻变化情况。可以发现，探测器的电阻变化量正比于乙烯浓度。

SWCNT 与石墨通过原位合成法生成的集成器件 可以用于检测 DMMP 的浓度。将集成器件印刷在通透性良好的胶带上，探测器通过胶带可以附着在各种生物的表面，监测 DMMP 的浓度。下图展示了探测器附着在富贵竹（D. sanderiana cv. Virens，Fig.a）叶片和锹甲（L. maculifemoratus dybowskyi parry，Fig.c）表皮上，探测器电阻变化量与 DMMP 浓度成正比。研究人员发现附着物表面的潮湿程度会影响探测器电阻的恢复时间已经检测过程中的噪音大小，如探测器在叶片（Fig.b）上的恢复时间、噪音都大于在干燥的昆虫表皮上（Fig.d）。

除了使用万用表测量探测器的电阻值外，研究人员还开发出了使用 无线电测定电阻值 的方法。将探测器设计为无源电路，利用电感耦合原理，探测器在接收电磁波后也会发射电磁波，但发射的电磁波因为探测器存在电阻所以出现了损耗，即发射的电磁波强度与探测器电阻成反比。通过测量发射电磁波的强度可以计算出探测器电阻，进而推断出 DMMP 浓度。下图 a 中为探测器结构，金色为线圈；b 中是探测器在不同浓度 DMMP 下发射的电磁波强度，可以发现随着 DMMP 浓度的升高，电磁波强度不断减弱。

4）局限

穿戴式纳米探测器也存在着研发难、多物质检测难等问题。同时，环境的湿度及温度也会较大的左右探测器的性能，如何保证探测器效力的稳定也是未来的研究方向之一。

总结