AbMole科研-在脂多糖诱导的急性肺损伤中，核SPHK2/S1P通过促进p53乙酰化诱导氧化

大量证据表明，巨噬细胞，包括滞留的肺泡巨噬细胞和从血液中招募的巨噬细胞，在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的发病机制中起着重要作用。然而，巨噬细胞通过促进氧化应激和炎症反应诱导急性肺损伤（ALI）的分子机制尚不清楚。

AbMole（https://www.abmole.cn/）精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是：在脂多糖诱导的急性肺损伤中，核SPHK2/S1P通过促进p53乙酰化诱导氧化应激和NLRP3炎症小体激活。

研究发现，ARDS患者外周血单个核细胞（PBMCs）中线粒体活性氧（mtROS）、SPHK2和激活的NLRP3炎性小体水平高于健康志愿者。在LPS处理的RAW264.7和THP-1细胞中也得到了类似的观察结果。LPS暴露后，巨噬细胞SPHK2酶活性、NLRP3炎性小体激活和mtROS显著上调。

此外，通过shRNA敲除或抑制SPHK2可显著降低LPS诱导的M1巨噬细胞极化、氧化应激和NLRP3炎性小体激活。进一步研究表明，上调SPHK2可提高核1-磷酸鞘氨醇（S1P）水平，进而抑制HDACs酶活性，促进p53乙酰化。p53的乙酰化增强了其与NLRP3启动子特定区域的结合，并驱动NLRP3的表达。

在体内实验中，观察到SPHK2特异性抑制剂Opaganib（ABC294640）治疗可以明显缓解LPS诱导的ALI，其表现为降低炎症细胞浸润，增加M2巨噬细胞极化，减轻肺组织氧化损伤。此外，抑制SPHK2还可以减少乙酰化p53蛋白的积累和NLRP3炎症小体的激活。

综上所述，研究结果首次证明，核S1P可以通过影响HDACs酶活性来调节非组蛋白的乙酰化水平，并将其与氧化应激和炎症反应的环境信号联系起来。这些数据为SPHK2可能是ARDS的有效治疗靶点提供了理论依据。

Opaganib（ABC294640）（Abmole M9383）是一种首创的（first-in-class），口服活性的，鞘氨醇激酶-2（SK2）选择性抑制剂，具有抗癌、抗炎症、抗病毒（COVID-19和SARS-CoV-2）活性。

更多详情可参见 https://www.abmole.cn/products/opaganib.html

线粒体功能障碍是氧化应激的一个标志，因此我们通过检测MMP和mtROS水平来评估LPS处理的巨噬细胞的线粒体功能。我们发现，在LPS暴露的巨噬细胞中，SPHK2的下调显著恢复了被破坏的MMP，并减弱了mtROS的释放（图3A, B）。然后，为了研究SPHK2是否可以调节NLRP3炎症小体的激活，我们分析了LPS暴露后SPHK2与NLRP3表达水平的相关性。如图3C所示，qRT-PCR结果显示SPHK2和NLRP3的mRNA表达呈正相关。Western blot分析也显示SPHK2活性与NLRP3蛋白表达呈正相关（图3D）。

 此外，免疫印迹和免疫荧光图像均显示NLRP3、ASC和cleaved caspase-1的积累（也通过ELISA检测;由LPS诱导的S1C）通过下调SPHK2而被基本消除（图3E, F）。通过使用ABC294640在人源性单核细胞THP-1中也证明了类似的现象。综上所述，这些结果表明，SPHK2在LPS触发的氧化应激和巨噬细胞NLRP3炎性小体激活中发挥了积极作用。

为了确定在体内阻断SPHK2活性是否可以改善LPS诱导的肺损伤，对肺组织进行了组织学检查。与受载物刺激的小鼠相比，感染后6小时ABC294640治疗明显减轻了LPS诱导的肺损伤，表现为出血减少和肺泡壁厚度减小（图6A）。同时定量各组肺损伤评分。与组织学检查结果一致，与LPS组相比，ABC294640处理组评分趋于降低（图6B）。

此外，与对照处理组相比，ABC294640处理小鼠LPS引发的组织损伤、炎症细胞浸润以及BALF蛋白浓度均显著降低（图6C, D）。需要强调的是，LPS诱导的肺损伤与氧化应激有关。因此，为了检测LPS暴露后肺组织氧化应激水平，测定了SOD、MPO和MDA的含量。

研究发现暴露于LPS的小鼠SOD含量降低，MPO活性和MDA水平升高。尽管如此，与LPS组相比，ABC294640治疗改善了肺组织的氧化损伤（图6E-G）。

由于巨噬细胞被认为是ALI发病的主要因素，我们想知道抑制SPHK2活性是否会影响体内LPS暴露时巨噬细胞的行为变化。如图7A-C所示，ABC294640处理可减少LPS暴露后F4/80+巨噬细胞向肺组织的浸润。此外，阻断SPHK2活性可明显诱导M2巨噬细胞极化。然后我们用qRT-PCR检测了ABC294640对肺组织炎症介质水平的影响。

结果显示，ABC294640处理明显抑制LPS诱导的炎症因子的积累（图7D）。根据上述结果，我们的数据揭示了抑制SPHK2可以缓解巨噬细胞诱发的肺组织氧化损伤和炎症反应。

接下来，通过免疫印迹和免疫组化染色检测肺组织中p53乙酰化和NLRP3炎症小体活化水平。与体外实验结果一致，体内数据表明，单独使用LPS可显著提高乙酰化p53蛋白水平。然而，ABC294640处理可以降低p53乙酰化（图8A）。如图8B所示，NLRP3在LPS暴露小鼠的AMs中高表达。

相比之下，免疫组化染色显示，暴露于ABC294640处理的LPS小鼠的AMs中NLRP3略有染色。对肺组织样本进行Western blotting，进一步检测NLRP3炎性小体的激活。LPS攻毒小鼠肺组织NLRP3、ASC和活化caspase-1水平均较PBS组上调。此外，ABC294640可显著降低NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1的表达水平（图8C、D）。

总之，研究表明，在体外和体内实验中，敲除或抑制SPHK2可通过调节p53乙酰化水平部分抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体激活和巨噬细胞中随后的炎症反应（图8E）。

鸣谢：Linjing Gong, et al. Cell Death Discov. 2023 Jan 18;9(1):12.