新型24-去羟基甾醇还原酶（DHCR24）抑制剂的虚拟筛选—AbMole科研快报

本期与您分享的是：新型24-去羟基甾醇还原酶（DHCR24）抑制剂的虚拟筛选及伊贝沙坦降胆固醇作用的生物学评价。AbMole（https://www.abmole.cn/）精研抑制剂十余年，最新的科研动态不断与您分享。

高脂血症是脂肪肝和动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病的危险因素，因此，降胆固醇被认为是预防心血管疾病的重要和有效的手段。3β-羟基甾醇-∆（24）-还原酶（DHCR24）催化去脂甾醇向胆固醇的转化，这是胆固醇生物合成途径的最后一步。我们推测阻断DHCR24的催化活性可能是治疗高脂血症的一种新的策略。

在本研究中，通过虚拟筛选DrugBank数据库并进行分子动力学模拟分析，选择了四种潜在的DHCR24抑制剂候选化合物：伊贝沙坦、利培酮、托伐普坦和考尼伐坦。所有四种候选化合物在HepG2细胞中均表现出显著的降胆固醇活性。高脂血症的实验小鼠模型表明，所有四种候选化合物都改善了高脂饮食喂养小鼠的高血脂水平和脂肪液泡化。

此外，Western blot分析结果表明伊贝沙坦通过下调低密度脂蛋白受体的表达来降低胆固醇水平。免疫复合物活性测定证实伊贝沙坦对DHCR24酶活性有抑制作用，其半最大抑制浓度（IC50）值为602 nM。

据我们所知，这是第一个报告通过竞争性抑制来阻断DHCR24酶活性的研究，是开发新的抗高脂血症或多种癌症的降胆固醇药物的潜在策略。考虑到伊贝沙坦目前用于高血压合并2型糖尿病，我们认为伊贝沙坦应该是高血压和高脂血症的合适选择。

Conivaptan（Abmole，M5166，纯度>99%）
https://www.abmole.cn/products/conivaptan-hydrochloride.html

考尼伐坦是一种非肽段类的 vasopressin receptor 拮抗剂，能够抑制大鼠肝脏的 V1A 受体和肾脏的V2受体，Ki 值分别为0.48和3.04 nM。

采用分子动力学模拟方法进一步研究了四种候选化合物及DHCR24-FAD配合物的动力学性质。结果与去氨甾醇-DHCR24-FAD复合物的结果进行了比较。蛋白质-配体复合物的均方根偏差（RMSD）在12 ns后保持稳定（图2A）。然后利用分子力学-广义玻恩表面积（MM-GBSA）方法截取平衡构象，计算各体系的结合自由能。与DHCR24+FAD+DES体系相比，DHCR24+FAD+IRB或DHCR24+FAD+CON体系具有更强的负结合能，表明考尼伐坦或伊贝沙坦对DHCR24的抑制效果更好。为了研究结合模式，我们截取了分子动力学模拟结果的最后一帧，并将DHCR24+FAD+DES体系分别与DHCR24+FAD和四个候选药物体系进行比对（图2B）。

结果表明，考尼伐坦并没有与去氨甾醇与DHCR24结合在同一个口袋上，而是在其活性口袋周围结合，这表明它可能通过阻止生理底物去氨甾醇进入活性口袋来抑制酶的活性。伊贝沙坦在DHCR24蛋白结构中的结合位置与去脂甾醇与DHCR24的结合位置相同。利培酮或托伐普坦与DHCR24蛋白的结合位置与底物去脂甾醇的结合位置略有偏离。

这些结果表明伊贝沙坦可以通过竞争性抑制更好地阻断DHCR24催化剂在胆固醇合成中的活性，而其他三种候选抑制剂的效果略差。

用指定的候选药物刺激HEPG2细胞后，采用filipin染色法测定细胞胆固醇含量。细胞边界处的荧光强度强于细胞其他部位，说明细胞膜中的胆固醇含量较高（图4A,B）。与细胞膜胆固醇含量最高的理论相一致。与S（+）和S（-）组相比，对照组（U18666A）和4个药物组的荧光强度显著降低，说明这些小分子候选药物可以抑制胆固醇合成，从而降低细胞内胆固醇含量。

利用Image-J分析各图像的相对荧光强度比（图4B）。与S（+）和S（-）组相比，U18666A和4种候选药物对HepG2细胞的胆固醇含量显著降低，表明虚拟筛选得到的4种药物具有抑制DHCR24活性和降低胆固醇的功能。HepG2细胞药物处理后，采用HPLC法检测胆固醇含量的变化（图4C）。

在所有组中，细胞中的胆固醇含量降低到HPLC检测不到的非常低的水平。这些数据证明，这四种候选药物在细胞水平上对DHCR24活性的抑制和胆固醇含量的降低具有实质性的作用。

采用高脂饲料喂养C57BL/6J小鼠，建立小鼠高脂血症模型。饲养4周，每周记录体重变化（图5A）。小鼠血清参数分析显示，与溶剂对照组（CMC-Na）相比，利培酮组和伊贝沙坦组小鼠血清总胆固醇（TC）水平降低，伊贝沙坦组、考尼伐坦组和托伐普坦组小鼠血清LDL-C含量降低。各组大鼠血清总甘油三酯（TG）含量均升高，血清HDL-C含量均降低。IRB组血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和LDL-C显著降低，HDL-C升高，这与分子动力学模拟结果一致（图5B）。

肝组织HE染色结果显示，与正常饮食小鼠（ND）相比，高脂肪模型载药对照组CMC-Na组小鼠的肝组织显示出更大的肝细胞和细胞内聚集的脂质。同时，脂质分散在细胞质中，细胞核被挤压到边缘，并有明显的空泡形成，证明高脂喂养小鼠成功建模。与高脂组相比，伊贝沙坦组、利培酮组、托伐普坦组和考尼伐坦组小鼠肝细胞体积变小，脂质空泡化减少。在辛伐他汀治疗的阳性对照中也观察到这些改善的表型。

这些结果表明，这四种药物都能改善高脂小鼠的高脂血症症状。根据小鼠血清生化指标的结果，伊贝沙坦在四种候选药物中表现明显更好（图5C）。

鸣谢：Haozhen Wang, et al. Molecules. 2023 Mar 14;28(6):2643.