法尼类固醇 X 受体激动剂 tropifexor 通过调节胆汁淤积性肝脏中的谷氨酰胺代谢和尿素循环来解毒

最新推荐文章于 2024-11-13 22:47:43 发布

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FXR在胆汁酸代谢中起着关键的调节作用，而TXR作为一种FXR激动剂，在NASH和PBC方面显示出良好的应用前景。

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本研究中的细胞实验主要关注了Tropifexor（TXR）对原代小鼠肝细胞中尿素生成的影响，以及FXR激活对谷氨酰胺代谢和尿素循环相关基因表达的调控。

细胞实验：

原代小鼠肝细胞的分离和培养：从成年小鼠中分离出原代肝细胞，并在体外进行培养。
TXR处理：将原代小鼠肝细胞或AML12小鼠肝细胞系暴露于不同浓度的TXR（0-5000 nM）或二甲基亚砜（DMSO）对照组中，处理24小时。
氨过量条件下的细胞处理：在TXR或DMSO处理后，将细胞置于含有2 mM NH4Cl、0.4 mM谷氨酰胺、0.6 mM鸟氨酸和10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液中，37°C、5% CO2的湿润环境中孵育1小时。
尿素生成的测定：使用尿素微孔板测定试剂盒（Bioworld Technology, ASK1160）测量培养基中的尿素浓度。
基因表达的测定：使用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）确定Glul、Cps1、Ass1、Asl1、Arg1和Otc基因的表达水平。

检测方法：

RNA提取：使用RNeasy试剂盒从原代小鼠肝细胞中提取总RNA。
cDNA合成：使用高容量cDNA逆转录试剂盒，将2 μg RNA逆转录为cDNA。
实时PCR反应：使用ViiA 7实时PCR系统和PowerUp SYBR-Green Master Mix试剂盒进行实时PCR反应。
数据标准化：所有样本均进行三次重复测定，数据归一化至内参基因Hprt1或Gapdh。
相对RNA表达水平计算：使用ΔΔCt方法计算相对RNA表达水平。
荧光素酶报告基因分析：克隆含有FXR响应元件（FXRE）ER-2的片段到pGL6-启动子荧光素酶载体中，并与FXR表达质粒共转染到HEK293细胞中。使用荧光素酶报告分析系统测定荧光素酶活性。

结论：

TXR处理增强了原代小鼠肝细胞中尿素的产生：TXR处理的细胞在暴露于过量NH4Cl后，培养基中的尿素浓度显著高于DMSO对照组。
TXR处理提高了尿素循环相关基因的表达：TXR处理增强了Glul、Ass1、Cps1、Asl和Arg1基因在原代小鼠肝细胞和AML12小鼠肝细胞中的表达。
FXR激活通过转录调控尿素循环和谷氨酰胺代谢相关酶：TXR激活FXR，增加了GLUL、ASS1、CPS1、ASL和ARG1基因的转录，这与FXR结合到这些基因启动子区域的FXREs有关。

研究中用到的Tropifexor购自 AbMole生物 Tropifexor | 1383816-29-2 | 美国AbMole | LJN452

这些结果表明，TXR可能通过促进尿素生成和谷氨酰胺合成来解毒氨，为胆管闭锁引起的高氨血症提供了潜在的新策略。