AbMole文献导读-缺氧通过M2/脂质负载巨噬细胞轴促进破骨细胞发生并驱动材料诱导的异位骨形成

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异位性骨化（HO）是一把双刃剑。病理性HO是一种临床并发症，而合成骨诱导材料控制异位骨形成在骨再生方面显示出良好的治疗潜力。然而，材料诱导异位骨形成的机制在很大程度上仍然未知。早期的HO通常伴随着严重的组织缺氧，这促使人们假设，由植入引起的缺氧协调了一系列细胞事件，最终导致骨诱导材料中的异位骨形成。

本文的数据显示了缺氧、巨噬细胞向M2极化、破骨细胞发生和材料诱导的骨形成之间的联系。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是细胞对缺氧反应的重要介质，在骨诱导磷酸钙陶瓷（CaP）植入早期高表达，而HIF-1α的药理抑制可显著抑制M2巨噬细胞、随后的破骨细胞和材料诱导的骨形成。

同样，在体外，缺氧可促进M2巨噬细胞和破骨细胞的形成。破骨细胞条件培养基增强间充质干细胞成骨分化，但这种增强作用在HIF-1α抑制剂的存在下消失。此外，代谢组学分析显示，缺氧通过M2/脂质负载巨噬细胞轴促进破骨细胞的发生。目前的研究结果揭示了HO的机制，并有利于设计更有效的骨再生骨诱导材料。

Rapamycin（Abmole，M1768，纯度>99%）雷帕霉素是一种选择性的mTOR抑制剂，IC50为~0.1 nM。

DFO（Abmole，M5129，纯度>99%）是一种荧光染料，与氨基酸反应形成高荧光衍生物（激发波长 ~470 nm；发射波长 ~570 nm）。用于检测纸上潜在指纹，有非常高的灵敏度。广泛应用于汗指纹显示鉴定。

Rosiglitazone（Abmole，M1894，纯度>99%）罗格列酮是一种具有口服活性的PPARγ选择性激动剂（EC50=60 nM, Kd=40 nM）。Rosiglitazone 还是一种 TRPC5 激活剂（EC50=30μM）和 TRPM3 抑制剂。

GSK2033（Abmole，M6768，纯度>99%）是一种LXR拮抗剂，对LXRα和LXRβ的pIC50值分别为7和7.4。

GW3965（Abmole，M1929，纯度>99%）是一种有效的，选择性LXR激动剂，作用于hLXRα和hLXRβ，EC50分别为190和30 nM。

Figure 2. Influence of HIF-1α inhibitors （rapamycin and PX-478） on expression of HIF-1α and macrophage polarization in MG and TCPB implants at week 1.

为了研究HIF-1α对体内巨噬细胞极化和破骨细胞形成的影响，我们使用了雷帕霉素和PX-478，它们已被证明可以抑制HIF-1α的转录。MG植入物小鼠每隔一天腹腔注射1周或2周，以TCPB为阴性对照，对植入物进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、免疫组织化学染色和基因分析（图2a）。

与MG对照组相比，在第1周，经雷帕霉素和PX-478处理的TCPB植入物和MG植入物中，HIF-1α阳性细胞减少，Arginase 1（ARG-1）阳性细胞减少，F4/80阳性细胞减少（图2b,c）。无论雷帕霉素和PX-478是否存在，在第1周，TCPB植入物和MG植入物中观察到的CCR7阳性细胞较少。同时，在第1周，TCPB组和MG组经雷帕霉素和PX478处理后，Hif-1α和Arg-1基因表达显著下调（图2e,f）。此外，双免疫荧光染色显示，MG植入物中ARG-1阳性细胞与HIF-1α阳性细胞共存（图2d）。

Figure 3. Influence of HIF-1α inhibitors （rapamycin and PX-478） on HIF-1α and osteoclastogenesis in MG implants at week 2.

为了研究HIF-1α对体内巨噬细胞极化和破骨细胞形成的影响，我们使用了雷帕霉素和PX-478，它们已被证明可以抑制HIF-1α的转录。MG植入物小鼠每隔一天腹腔注射1周或2周，以TCPB为阴性对照，对植入物进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、免疫组织化学染色和基因分析（图3a）。

与MG对照组相比，在第2周，经雷帕霉素和PX-478处理的TCPB植入物和MG植入物中，HIF-1α阳性细胞和Cathepsin K（CTSK）阳性细胞较少（图3b,d）。第2周，MG雷帕霉素组、MG PX-478组和TCPB组几乎未见TRAP阳性细胞（图3f）。与组织学分析一致，与MG对照组相比，MG雷帕霉素组、MG PX-478组和TCPB组在第2周检测到Hif-1α、TRAP和Ctsk基因表达显著减少（图3c、e、g）。

Figure 4. Time-dependent HIF-1α activation and influence of HIF-1α inhibitors on bone formation following intraperitoneal injection.

为了研究HIF-1α对材料诱导骨形成的影响，我们将HIF-1α抑制剂（雷帕霉素和PX-478）和HIF-1α激活剂（去铁胺，DFO）分别在早期或后期通过腹腔注射或种植体周围注射应用于植入物的小鼠（图4c）。对于早期处理，在前2周每隔一天施用化学药品。对于后期治疗，从第2周至第4周或从第4周至第6周每隔一天注射一次化学药物。注射PBS作为对照，如有必要，在第6周收获样品进行组织学评估，并使用非脱钙切片进行组织学和组织形态计量学分析。同时，从第1周到第4周，对TCPB和MG植入物中HIF-1α的激活情况进行基因表达评估（图4a）。

与TCPB植入物相比，MG植入物中Hif-1α基因表达在第1周和第2周均上调，随后下调，导致MG植入物与TCPB植入物在第3周和第4周无差异（每种材料每个时间点，图4b）。种植体的骨形成不仅与化学治疗有关，而且与治疗时间有关。在0-2周期间腹腔注射雷帕霉素和PX-478，在第6周显著抑制MG植入物的骨形成（图4d-f），当在2-4周和4-6周期间腹腔注射雷帕霉素时，雷帕霉素没有抑制骨形成（图4d-f）。在0-2周期间在种植体周围注射雷帕霉素和PX-478可以抑制第6周MG种植体的骨形成，而在0-2周期间在种植体周围注射DFO可以增强MG种植体的骨形成。种植体周围注射DFO使第6周TCPB种植体成骨成为可能，成骨发生率为7/8（第6周8个TCPB种植体中有7个），TCPB种植体可用空间骨面积百分比为0.07±0.11%。腹腔注射PBS对MG植入物第6周骨形成无影响（0.76±0.33% vs 0.69±0.23%，图4e,f），而种植体周围注射PBS增加了MG种植体第6周的骨形成（0.76±0.33% vs 1.32±0.29%）。

Figure 5. Influence of hypoxia and rapamycin on macrophage polarization and osteoclastogenesis of mBMDMs in vitro.

分别用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）单独或联合核因子受体激活剂-κB配体（RANKL）体外培养mBMDMs，探讨影响巨噬细胞极化和破骨细胞发生的因素（图5a）。在巨噬细胞极化培养系统中引入雷帕霉素可显著下调Arg-1基因表达（图5c），并对CD206阳性细胞数量产生负影响（图5b），但对Cd163基因表达无显著影响（图5c）。低氧显著上调巨噬细胞极化培养中Arg-1基因表达（图5c），但对CD206阳性细胞（图5b）和Cd163基因表达（图5c）影响不大。

此外，流式细胞术显示，与正常氧培养相比，单独使用M-CSF低氧培养3天，CD206阳性细胞比例更高（图5e），而CCR7阳性细胞比例更低。正常氧培养CD206阳性细胞比例为59.43±1.30%，低氧培养CD206阳性细胞比例为82.63±0.64%（图5e）。正常氧培养CCR7阳性细胞比例为35.60±1.28%，低氧培养CCR7阳性细胞比例为29.27±2.48%。在体外破骨细胞形成评价系统中，雷帕霉素在第5天急剧下调TRAP基因和Ctsk基因的表达（图5h），并在第5天减少TRAP阳性细胞的数量和面积（图5d,f）。低氧在第5天显著上调TRAP基因和Ctsk基因（图5h），并在第5天增加TRAP阳性细胞的数量和面积（图5d,f）。低氧条件下第3天CTSK阳性细胞胞体大，正常氧条件下CTSK信号未见典型破骨细胞形态，雷帕霉素组第3天未见CTSK信号（图5g）。

流式细胞术显示，与正常氧培养相比，M-CSF和RANKL低氧培养5天的CD61（破骨细胞标志物）阳性细胞比例更高（图5i）。正常氧培养CD61阳性细胞比例为16.57±0.25%，低氧培养CD61阳性细胞比例为25.70±0.56%（图5i）。此外，流式细胞术显示雷帕霉素急剧减少CD61阳性细胞，雷帕霉素组CD61阳性细胞为6.94±0.27%，对照组CD61阳性细胞为16.63±0.21%。

Figure 6. Transcriptomic and targeting metabolomics analysis of osteoclastogenesis culture with/without rapamycin.

将mBMDMs在含/不含雷帕霉素的破骨培养基中培养4天，以鉴定破骨细胞发生过程中的关键代谢组学（图6a）。转录组分析显示，在雷帕霉素组中，破骨细胞发生相关基因（如TRAP（Acp5）、Ctsk、Mmp9、Itgb3、Nfact1、Dc-stamp、Ckb、Calcr、Atp6v0d2、Oc-stamp、Oscar）显著下调（图6b）。RT-qPCR证实了这种基因表达趋势（图6d）。

同时，脂质积累相关基因（Srebf1、Lss、Hmgcs1、Slc25a1、Fads2、Scd1、Scd2）在雷帕霉素组中显著下调（图6c）， RT-qPCR也证实了这种基因表达趋势（图6d）。对差异表达基因进行基因组（KEGG）分析时，显示了下面的相关信号通路，雷帕霉素组代谢通路和HIF-1信号通路显著下调（图6e）。靶向代谢组学分析显示，雷帕霉素组总脂质的下调（图6g）。在所有脂质中，受雷帕霉素影响最大的是磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰胆碱（PC）（图6f）。

Figure 7. Influence of lipid accumulation on osteoclastogenesis.

当用雷帕霉素处理mBMDMs时，与M-CSF和RANKL存在的培养相比，雷帕霉素组在第2天观察到的脂滴（油红O染色）较少（图7b,c），雷帕霉素组在第2天，第3天和第4天观察到的cd36阳性细胞显著减少（图7k,j）。相比之下，低氧显著增加了第2天脂滴的数量和面积（图7b,c）。将脂质积累抑制剂GW3965引入mBMDMs（同时含有M-CSF和RANKL）的破骨培养中（图7a），在第4天显著减少mBMDMs破骨培养中TRAP阳性细胞和脂滴（图7 d, e, f, g）。将脂质积累激活剂GSK2033引入mBMDMs的破骨细胞培养中，第4天TRAP阳性细胞和脂滴显著增加（图7 d, e, f, g）。

为了研究PE暴露在细胞表面是否在功能上参与破骨细胞融合，我们将与PE特异性结合的肉桂素引入到mBMDMs（含M-CSF和RANKL）的破骨细胞培养中。第4天未见TRAP阳性细胞（图7h,i）。当巨噬细胞融合的分子介质CD36被抗CD36抗体阻断后，mBMDMs破骨培养中TRAP阳性细胞的数量和面积均显著减少（图7h,i）。

Figure 8. Influence of rosiglitazone on macrophage polarization and osteoclastogenesis in vitro.

当mBMDMs单独与M-CSF或与M-CSF和罗格列酮（M2激活剂）一起培养4天（图8a）时，罗格列酮在第4天显著增加了mBMDMs培养中Arg-1基因的表达（图8h）。当罗格列酮被引入破骨培养基（同时含有M-CSF和RANKL）时，在第4天mBMDMs的破骨培养中，它显著增加了破骨细胞的数量、细胞大小和面积（图8b-e）。同时，罗格列酮显著增加了第2天mBMDMs破骨细胞培养中脂滴的数量和面积（图8f,g）。

Figure 9. Osteogenic function of osteoclastogenesis.

通过使用/不使用破骨细胞生成条件培养基和使用雷帕霉素的条件培养基培养MSCs 7天，评估破骨细胞生成对MSCs成骨分化的影响（图9a）。通过在含雷帕霉素/不含雷帕霉素的成骨培养基中培养MSCs 7天来评估雷帕霉素对MSCs成骨分化的影响，结果表明，在与实验组条件培养基（破骨条件培养基加雷帕霉素）相同的浓度下，雷帕霉素不抑制MSCs的成骨分化。MSCs培养第7天碱性磷酸酶（ALP）染色显示，与阴性对照（无破骨细胞条件培养基）相比，破骨细胞条件培养基（阳性对照）提高了ALP的产生，而在mBMDMs的破骨细胞培养中引入雷帕霉素后，破骨细胞条件培养基的这种成骨功能下降（图9b）。

此外，Alp基因的表达方式与Alp的产生方式相同（图9c）。同时，在体外破骨细胞生成评价系统中，雷帕霉素在第5天急剧下调Cthrc1基因和Sphk1基因的表达（图9d），并降低M-CSF和RANKL培养5天mBMDMs分泌的Cthrc1和S1P蛋白水平（图9e）。

鸣谢：Dan Li, et al. Adv Sci (Weinh). 2023 Mar 27;e2207224.