AbMole科研 - 壁细胞线粒体GRIM-19缺失通过NLRP3介导的IL-33活化，激活ROS-NRF2-HO-1-NF-κB轴，促进解痉多肽表达化生

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解痉多肽表达化生（SPEM）是肠上皮化生（IM）的肿瘤前前体，在慢性萎缩性胃炎（CAG）和胃癌（GC）的发生发展中起重要作用。然而，对SPEM发病机制的致病靶点仍知之甚少。作为线粒体呼吸链复合体I的重要亚基，与类视黄酮-IFN诱导死亡19（GRIM-19）相关的基因随着人类CAG的恶性转化而逐渐丢失，但关于GRIM-19丢失与CAG发病机制之间的潜在联系尚不清楚。

在这里，我们发现较低的GRIM-19与CAG病变中较高的NF-кBRelA/p65和NLR家族3（NLRP3）水平相关。在功能上，GRIM-19缺乏不能直接驱动人GES-1细胞在体外分化为IM或SPEM样细胞系，而壁细胞（PCs）特异性GRIM-19敲除会扰乱胃腺分化，促进小鼠无肠道特征的自发性胃炎和SPEM发病。从机制上说，GRIM-19的丢失导致慢性粘膜损伤，并通过活性氧（ROS）介导的氧化应激导致NRF2（核因子-红细胞2相关因子2）- HO-1（血红素加氧酶-1）的异常激活，通过IKK/IкB伴侣诱导p65核易位导致NF-кB异常激活，而NRF2-HO-1的激活通过NRF2-HO-1正反馈回路促进GRIM-19丢失驱动的NF-кB激活。

此外，GRIM-19的丢失并未导致明显的PCs丢失，但通过ROS-NRF2-HO-1-NF-кB轴触发PCs中的NLRP3炎性体激活，导致NLRP3依赖性IL-33表达，这是SPEM形成的关键介质。

此外，腹腔注射NLRP3抑制剂MCC950可显著减轻体内GRIM-19损失驱动型胃炎和SPEM。研究表明，线粒体GRIM-19可能是SPEM发病的潜在致病靶点，其缺失通过ROS-NRF2-HO-1-NF-кB轴通过NLRP3/IL-33途径促进SPEM。这一发现不仅提供了GRIM-19缺失与SPEM发病机制之间的因果关系，而且为早期预防肠GC提供了潜在的治疗策略。

CDCA（Abmole，M2507，纯度>98%）（https://www.abmole.cn/products/chenodiol.html）是一种天然存在的人体胆汁酸。

NAC（Abmole，M5385，纯度为100%）（https://www.abmole.cn/products/acetylcysteine.html）是ROS抑制剂，拮抗多种蛋白酶体抑制剂的活性。它还是肿瘤坏死因子TNF的抑制剂。

ML-385（Abmole，M8692，纯度为100%）（https://www.abmole.cn/products/ml385.html）是一种特异性的 NRF2 抑制剂，IC50 为1.9 μM。ML385通过结合Neh1抑制Nrf2转录因子的活性。

VX-765（Abmole，M3532，纯度>99%）（https://www.abmole.cn/products/vx-765.html）是一种是有效的选择性的 caspase-1 抑制剂，对 caspase-1的Ki值为 0.8 nM。

PDTC（Abmole，M4005，纯度>99%）（https://www.abmole.cn/products/pdtc.html）是一个有效的NF-κB抑制剂，它可以抑制IκB的磷酸化、阻止NF-κB易位入核并减少下游细胞因子的表达。

Fig. 3. GRIM-19 deletion induces gastric mucosa injury by ROS-driven oxidative stress in vitro and in vivo.

接下来，我们研究了GRIM-19缺乏对慢性黏膜损伤的影响，慢性黏膜损伤是引发SPEM的关键因素。如图3A-D所示，我们观察到，在体外和体内，GRIM-19缺失显著增加了细胞内ROS和mROS，以及ROS诱导的DNA损伤标志物 8-OHdG。此外，我们进一步观察到，在体外和体内，GRIM-19缺失显著降低GSH/GSSG比值，增加NADP+/NADPH比值（图3E和F），表明GRIM-19缺失通过ROS诱导的氧化应激导致胃粘膜损伤。

鉴于NRF2抗氧化应激的主要靶点，我们研究了GRIM-19缺失是否会导致NRF2异常激活。正如预期的那样，我们发现GRIM-19缺陷显著增加了NRF2在体外和体内的激活（图3G和H），而ROS清除剂NAC显著减弱了GRIM-19缺陷诱导的NRF2、p-NRF2及其下游HO-1水平以及GES-1细胞中NRF2的转录激活（图3I），表明GRIM-19缺陷诱导了ROS依赖性NRF2的激活。综上所述，这些数据表明，在体外和体内，GRIM-19缺乏可引起ROS诱导的氧化应激对胃粘膜的损伤和NRF2-HO-1的异常激活。

Fig. 4. GRIM-19 loss drives ROS-dependent NF-кB activation by promoting p65 nuclear translocation via an IKK/IкB partner.

鉴于ROS在氧化应激和信号转导中的双重作用，我们研究了GRIM-19缺乏对NF-кB激活的影响，NF-кB是黏膜炎症的关键转录因子。我们发现GRIM-19缺失没有改变p65的总水平，但显著提高了p-p65活性和NF-кB响应靶点水平（图4A和B）。

我们还发现GRIM-19缺失不仅显著改变了NF-κB调节蛋白p-IKKα/β、IKKα/β、p-IкB-α和IкB-α（图4C），还显著诱导了GES-1细胞中的p65核易位（图4D）。NF-кB抑制剂PDTC和BAY11-7082显著消除了GES-1细胞中GRIM-19缺陷驱动的p65激活及其下游靶标水平（图4E和F），表明GRIM-19缺陷通过IKK/IкB合作伙伴促进p65核转运，从而诱导NF-κB-p65激活。

为了进一步确定ROS在GRIM-19缺失驱动的NF-кB激活中的作用，我们接下来应用ROS清除剂NAC来评估ROS抑制是否可以逆转GRIM-19缺失驱动的NF-кB p65激活。我们发现，NAC处理显著减弱了GRIM-19缺失驱动的p65激活（图4G）和NF-кB下游靶标水平（图4H）。同时，NAC处理显著逆转了GRIM-19缺陷诱导的NF-кB调节蛋白（图4I）。因此，这些结果表明，GRIM-19缺失通过IKK/ IкB合作伙伴促进p65核易位，从而驱动ROS依赖性NF-кB激活。

Fig. 5. NRF2 activation is essential for ROS-driven NF-кB activation in GRIM-19-deficient GES-1 cells.

考虑到GRIM-19缺失的GES-1细胞中存在NRF2异常，我们进一步研究了NRF2激活是否对GRIM-19缺失驱动的NF-кB激活至关重要。使用NRF2特异性抑制剂ML-385，我们发现NRF2抑制显著降低了GRIM-19缺失诱导的NRF2激活（图5A）和p65激活（图5B）。

此外，NRF2抑制不仅逆转了GRIM-19缺陷驱动的NF-кB下游靶标（图5C）和NF-кB调节蛋白水平（图5D），还明显减弱了GRIM-19缺失诱导的p65核易位（图5E）。这表明NRF2激活对于GRIM-19损失驱动的NF-кB激活至关重要，通过IKK/IкB伙伴诱导p65核易位。

接下来，我们使用NRF2激活剂ALA来研究NRF2激活对亲代GES-1细胞中NF-кB p65激活的影响。我们发现ALA处理增强了GES-1细胞中NRF2（图5F）和p65的激活（图5G），并显著改变了NF-кB下游靶标（图5H）和NF-кB调节蛋白水平（图5I）。此外，ALA处理后核p65水平明显升高（图5J）。因此，这些数据表明NRF2激活通过在GES-1细胞中通过IKK/IкB诱导p65核易位来促进NF-кB激活。

Fig. 7. GRIM-19 loss triggers NLRP3/IL-33 activation via a ROS-NRF2-HO-1-NF-кB axis.

鉴于异常IL-33在SPEM发病机制中的关键作用，我们试图了解IL-33是否参与了GRIM-19丢失诱导的SPEM。通过FACS和Western blot分析，我们观察到GRIM-19缺失在体外和体内显著增加IL-1β和IL-33水平以及NLRP3炎性体的激活（图7A-D）。然后，特异性抑制ROS（图7E）、NRF2（图7F）、HO-1（图7G）或NF-кB（图7H）分别显著降低了GRIM-19损失驱动的NLRP3炎症小体、IL-1β和IL-33水平，表明ROS-NRF2-HO-1-NF-кB轴对GRIM-19损失驱动的NLRP3炎症小体激活以及IL-1β和IL-33表达至关重要。

接下来，我们探讨了NRF2-HO-1反馈回路在GRIM-19损失驱动的NLRP3炎症小体中的确切作用。我们发现NRF2激活剂ALA明显增强了GES-1细胞中NLRP3炎性小体的激活以及IL-1β和IL-33水平，而HO-1抑制可以显著减弱这种激活，这表明NRF2-HO-1反馈回路在GRIM-19损失驱动的NLRP3炎性小体、IL-1β和IL-33表达中起着重要作用。因此，这些结果表明，GRIM-19的缺失通过ROS-NRF2-HO-1-NF-кB轴驱动NLRP3的激活。

接下来，我们使用NLRP3抑制剂MCC950或caspase-1抑制剂VX-765进一步确定NLRP3复合物在GRIM-19损失驱动的IL-1β和IL-33加工中的作用。如图7I和J所示，MCC950和VX-765处理均显著降低了GRIM-19缺陷驱动的IL-1β水平，而只有MCC950而不是VX-765显著消除了GRIM-19缺失诱导的IL-33表达，这表明GRIM-19缺失诱导了NLRP3炎症小体介导的IL-1β成熟，但NLRP3依赖性IL-33在GES-1细胞中的加工。

总的来说，这些结果表明，GRIM-19缺失通过ROS-NRF2-HO-1-NF-кB轴触发NLRP3/IL-33的异常激活。

鸣谢：Xin Zeng, et al. Free Radic Biol Med. 2023 Mar 27;202:46-61.