AbMole文献导读-双酚A通过miR-215-3p/Dio1激活ROS/PI3K/AKT通路，加重硒缺乏诱导的动脉细胞凋亡

双酚A（BPA）和硒（Se）缺乏均可影响microRNAs（miRNAs）的表达，特异调控其靶mRNA并诱导细胞凋亡，在心血管损伤性疾病中发挥重要作用。

AbMole（https://www.abmole.cn/）精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。

为了探讨BPA和硒缺乏诱导动脉内皮组织凋亡的机制以及miRNA在这一过程中的作用，我们采用了BPA暴露/硒缺乏的鸡和PAEC细胞模型。

双荧光素酶基因报道证实了miR-215-3p与PAEC中碘甲状腺原氨酸脱碘酶1（Dio1）的靶向关系。qRT-PCR检测miR-215-3p水平。采用氧化应激试剂盒和DCFH - DA探针法检测动脉内皮细胞氧化应激水平。采用qRT-PCR和western blot检测PI3K/AKT通路、线粒体动力学和凋亡相关基因。检测线粒体ATP水平和一氧化氮合酶（NOS）水平。采用TUNEL、吖啶橙/溴化乙啶、流式细胞术检测细胞凋亡水平。

结果表明，BPA暴露和硒缺乏导致动脉内皮细胞miR-215-3p过表达，氧化应激加重，抑制PI3K/AKT通路激活，促进线粒体分裂，增加凋亡相关基因表达，最终导致动脉内皮细胞凋亡。我们还在体外建立了miR-215-3p和Dio1的敲除/过表达模型，发现miR-215-3p的过表达和Dio1的敲除可诱导细胞凋亡。有趣的是，miR-215-3p-抑制剂和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）部分阻止BPA暴露和硒缺乏引起的细胞凋亡，LY294002加重细胞凋亡。

这些结果表明，BPA暴露通过调节miR-215-3p/Dio1激活的ROS/ PI3K/AKT通路，加速了鸡硒缺乏动脉内皮细胞的凋亡。miR-215-3p/Dio1轴为了解BPA暴露和硒缺乏的毒性机制提供了新的途径，并揭示了血管疾病中细胞凋亡损伤的新调控模型。

LY294002（Abmole，M1925，纯度>99%）（https://www.abmole.cn/products/ly294002.html）是一种广谱的PI3K抑制剂，对PI3Kα/δ/β的IC50分别为0.5 μM/0.57 μM/0.97 μM。LY294002 也可以抑制 CK2 的活性，IC50 为 98 nM。LY294002 还是一种竞争性 DNA-PK 抑制剂，可逆结合 DNA-PK 的激酶结构域，IC50 为 1.4 μM。

NAC（Abmole，M5385，纯度为100%）（https://www.abmole.cn/products/acetylcysteine.html）是ROS抑制剂，拮抗多种蛋白酶体抑制剂的活性。它还是肿瘤坏死因子TNF的抑制剂。

Figure2 Effects of BPA exposure and Se deficiency on oxidative stress and NOSs activity in chicken arteries.

为了评估硒缺乏和BPA对动脉氧化应激的影响，采用试剂盒测定了动脉组织中抗氧化酶CAT、GSH、GPX、SOD的活性和MDA的水平。如图2所示，与对照组相比，−Se组和BPA组MDA水平急剧升高，−Se组和BPA组CAT、GSH、GPX、SOD活性显著降低（图2a）。特别是，−Se+BPA组MDA水平显著高于−Se和BPA组，−Se+BPA组CAT、GSH、GPX、SOD活性显著低于−Se和BPA组（图2a）。

为了进一步评估BPA和硒缺乏对PAEC的影响，我们首先通过CCK-8毒性试验确定BPA的最佳暴露浓度为200 nM（图2e）。然后，我们选择BPA（200 nM）和缺硒培养基处理PAEC细胞，如图2b所示，进行后续实验。PAEC细胞中ROS检测结果显示，−Se组和BPA组的ROS水平分别比对照组高16.3%和23.9%，−Se +BPA组的ROS水平分别比−Se组和BPA组高23.7%和16.1%（图2h,d）。

结果表明，BPA暴露和硒缺乏可诱导动脉氧化应激。NOS作为调控血管功能的关键信号分子，在血管内皮细胞功能的调控中起着关键作用。eNOS和iNOS的激活导致心血管异常，并调节血管收缩和舒张。采用Elisa试剂盒检测eNOS和iNOS活性。

结果发现，与对照组相比，−Se组和BPA组eNOS酶活性均显著降低，其中−Se +BPA组尤显著，与−Se组和BPA组相比，−Se+BPA组eNOS酶活性显著降低，iNOS酶活性呈相反趋势（图2c）。结果表明，BPA和硒缺乏引起内皮功能障碍。

Figure 7 BPA exposure and Se deficiency regulate apoptosis of chicken arterial endothelial cells by activating ROS/PI3K/AKT pathway viamiR-215-3p/Dio1 axis.

首先，我们将SiDio1转染到PAEC细胞中，敲除目标基因Dio1。通过qRT-PCR，我们证实了Dio1的mRNA水平明显降低（图7f），表明Dio1的敲除成功，可以进行后续的实验。

为了评估Mimic抑制剂和SiDio1转染对PAEC细胞中ROS水平的影响，我们采用图7a所示的处理方法在PAEC细胞中进行后续实验（图7a）。通过CCK-8毒性试验获得NAC（4 mM）（图2f）和LY294002（10 μM）（图2g）的最佳浓度。为了探究miR-215-3p/Dio1轴与ROS的调控关系，我们利用荧光显微镜检测PAEC细胞的ROS水平。

结果表明，miR-215-3p-Mimic和siDio1均可诱导PAEC细胞中的ROS爆发，并且在NAC预处理和miR-215-3p抑制剂转染的PAEC细胞中，ROS水平显著降低（图7b,g）。

鸣谢：Zhe Li, et al. J Cell Physiol. 2023 Apr 3.1-19.