荧光和量子点的基本原理和发展历史 / 数码显微镜摄像头和图像分析的基础技术术语定义

斐夷所非

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分类专栏： optics 文章标签：光学

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无处不在的荧光显微镜技术改变了显微镜学家对研究对象进行成像、标记和追踪的方式，不论是整个生物体，还是单个蛋白质等等。

本文将探讨什么是 “荧光”，包括其定义背后的历史和基础物理原理，绿色荧光蛋白（GFP）的发现和应用，并展望量子点等荧光探针不断扩大的应用领域。

November 15, 2017
Authors
Martin Wilson , PhD

我们如何定义 “荧光”？

在任何搜索引擎中输入 “荧光的定义”，你会得到以下语句，或者非常相似的内容；

“由较短波长的入射辐射，如 X 射线或紫外线，某些物质会发出可见或不可见的辐射。”

这个定义与荧光显微镜（图 1）有何关联呢？“波长较短的入射辐射” 只是用来 “激发” 样品发射荧光的光源。这种光线包括可见光、紫外线（UV）和红外线（IR），显微镜的光源可以是汞或氙弧光灯，也可以是激光。荧光基团（即上述定义中的 “某些物质”）是具有特殊性质的化合物，它们在较短波长光线的激发下，可以再次发射较高波长的光线 / 光子。

图 1：荧光显微镜下显示的荧光标记细胞。

波长的基本单位是米，“波长” 定义为光波的两个连续波峰或波谷之间的距离。波长的符号是希腊字母 λ(l)。显微镜使用的波长通常以纳米（nm）为单位，可见光谱段在 400 至 700 纳米之间，紫外光谱段在 400 纳米以下，红外光谱段从 700 纳米开始（图 2）。

图 2：可见光光谱

荧光基团按其激发和发射波长分类，通常以图形的形式显示最大波峰。荧光基团在所谓的 “基态” 中自然稳定。它们吸收到（来自 “较短波长” 入射光的）光子时，光子的能量将荧光基团的电子提升到更高能量的 “激发” 状态。被激发的电子不会保持在这种状态，而会失去振动能量，并在返回基态时发射出一个较长波长的光子。对于显微镜使用荧光基团，从激发到返回基态的一个完整周期需要 0.5 到 20 纳秒。

荧光基团的激发和发射波长通常缩写为希腊字母 lambda，加上下标 “ex”（激发）或 “em”（发射；即 lex 或 lem）。

每个荧光基团都有一个不同的最大激发和发射谱段，这一特性用来区分同一样品中的不同标靶。例如，使用荧光染色剂 DAPI (4’,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚）高亮显示细胞中的核蛋白，同时使用荧光标记的鬼笔环肽来高亮显示肌动蛋白细胞骨架。

荧光的雅布隆斯基图

波兰物理学家亚历山大・雅布隆斯基（Aleksander Jablonski，1898-1980）首先用三能级能量图描述了基态 / 激发 / 发射之间的循环，因此称为 “雅布隆斯基图”。 1930 年，他凭借题为《关于激发光波长变化对荧光光谱的影响》的论文获得华沙大学博士学位。1933 年，他在《自然》杂志上发表了自己的论文（《染料中反斯托克斯荧光的效率》”），其中含有雅布隆斯基图。这种简单而有效的示意图清晰表现出荧光基团从基态到激发态的激发行为，然后在发射较长波长光子后回到基态（图 3）。

虽然图 3 是简化版的雅布隆斯基图，但应该可以注意到，荧光基团可以存在多个不同的激发和发射状态。此外，荧光基团可以通过不同的弛豫状态返回基态，这些弛豫状态被称为 “三重态”，具体取决于分子的电子自旋。

斯托克斯位移

乔治・加布里埃尔・斯托克斯爵士（1819-1903）是爱尔兰数学家和物理学家，他一生中在光学和光线领域颇有建树。1849 年他受命担任剑桥彭布罗克学院的卢卡斯数学教授，并一直担任该职务，直到 1903 年去世。他写了一篇文笔优美的描述性论文，发表于 1852 年，名为《论光的折射性的变化》[1]。他在论文中使用的语言不同于我们在现代科学文献中使用的语言。以下是斯托克斯爵士所用精彩语言的两段简短摘录；

“去年深秋，虽然因为节气迟来，观察机会不多，我从不同渠道得知，之前提到过的那种具有高内色散性的黄色玻璃采用氧化铀染色。”

以及：

“看到试管在浸入不可见光线的瞬间点亮，这当然是一个奇怪的景象：那实际上是可见的黑暗。总的来说，这种现象有点不可思议。”

“斯托克斯位移” 这词就是为了纪念这位科学家。当激发的电子回到基态并发出光子时，其波长始终大于激发荧光基团的入射光线的波长。这是由于光的特性，即波长与辐射能量成反比。斯托克斯位移描述了荧光基团的峰值激发波长和峰值发射波长之间的差值（以纳米为单位）（图 4）。

图 4：斯托克斯位移发射光的波长始终大于用来激发荧光基团的光线波长。

增加斯托克斯位移，荧光基团的激发光和发射光之间区别就越明显。荧光基团的电子排布和分子结构令其在斯托克斯位移方面有着独特的性质。

绿色荧光蛋白的发现与应用

斯托克斯爵士首先使用 “荧光” 这个术语来描述他观察到的现象，但其发现可以追溯到 1565 年。来自西班牙的医生兼植物学家尼古拉斯・莫纳德斯（Nicolas Monardes）描述了一种墨西哥树（Lignum nephriticum），其木头被注入了奇怪的蓝色。尽管有这些早期的观察，但直到约 400 年后，人们才在活体组织中找到一种绿色荧光物质。1955 年，Davenport 和 Nicol 发表论文 [2]，描述了一种在称为水螅水母（Hydromedusae）的水母亚纲生物的嗜酸性粒细胞中找到的发光组织。当时，两位论文作者并没有意识到这些嗜酸性粒细胞含有绿色荧光蛋白（GFP）。

直到 1962 年，下村脩（Osamu Shimomura，出生于 1928）发表了一篇论文 [3]，认定这种发光成分是一种蛋白质。通过与他在普林斯顿大学的老师（弗兰克・约翰逊教授）合作，他们从生物发光水母 Aequorea Victoria（维多利亚多管发光水母）身上收集到样本。他们用一种独特的方法从水母中分离出荧光蛋白，即通过棉布袋挤压分离的生物发光组织，产生一种被下村称为 “挤压物” 的溶液。

1994 年，哥伦比亚大学的马丁・查尔菲（Martin Chalfie，出生于 1947 年）教授发表论文，证明了基因编码 GFP 可以在原核细胞和真核细胞（即大肠杆菌和秀丽隐杆线虫的神经元）中实现功能表达 [4]。该论文写道 “由于这种荧光不需要外源底物和辅助因子，GFP 表达可以用于监测生物体内的基因表达和蛋白质定位。” 正是这篇文章的发表为 GFP 在生物学研究中的广泛应用铺平了道路。

图 5：线虫，GFP 在神经系统中的表达。

一年后，一直在研究野生型 GFP 突变体的加州大学圣迭戈分校教授钱永健（1952-2016）在《自然》的科学通讯上发表了自己的论文 [5]。钱教授和他的同事发现，他们选择的一个单点突变（S65T）具有最长的激发和发射波长 (490/510nm)，这令它更具有光稳定性，并带来众所周知的 GFP 激发 / 发射峰。

2008 年，下村脩、钱永健和查尔菲因在 GFP 的发现和应用方面发挥的重要作用共同获得诺贝尔化学奖。下村脩在他的诺贝尔演讲中表示，“当我在 1979 年发现 GFP 的发色团时，我认为自己已经完成了所有研究工作，因而决定终止我在 GFP 方面的工作，以便集中精力研究生物发光”。他接着承认，“GFP 是一种美丽的蛋白质，但在发现之后的 30 年中，它依然百无一用。”

自从钱永健发现 GFP 的应用之后，他的实验室已经设计出多种 GFP 变体，涵盖了大部分的可见光谱，并彻底改变了光学显微镜和成像领域。得益于这种基因工程，GFP 的色彩范围从光谱的蓝色谱段（EBFP；380/460 纳米）到光谱的黄色谱段（YFP；514/527 纳米）。

报告基因和探针

除了成像领域，荧光团可以作为研究细胞和生物体中基因表达的 “报告基因”。荧光素酶以及基因编码 GFP，就是检查细胞是否表达特定基因的常用报告基因。生物体或细胞被基因改造的病毒 DNA 或质粒转染，当目标基因获得表达时，这些质粒会发出荧光。细胞内部的相关细胞器或位点可以在受转染的细胞中进行观察和检查。

利用荧光基团标记（或 “标注”）的抗体通常称为 “荧光探针”。在 GFP 和其他荧光基团得到广泛应用之前，两种最常用的荧光基团标记抗体是 FITC（异硫氰酸荧光素）和 TRITC（异硫氰酸四甲基罗丹明）。尽管 FITC 和 TRITC 仍在使用，但该领域已取得重大进展，至少可以说，荧光基团和探针的选择非常广泛。

当然，如今实验室中使用最为广泛的荧光基团之一是 “Alexa Fluor” 染色剂。目前 Alexa Fluor 染色剂的可用色彩范围已超越可见光谱，其中激发波长范围可达 346 至 784 纳米。

量子点

1981 年，俄罗斯科学家阿列克谢・埃基莫夫（Alexey Ekimov）在圣彼得堡瓦维洛夫国立光学研究所工作时，首次在玻璃基质中发现了量子点。然而，在新泽西州 AT&T 贝尔实验室从事半导体工作的路易斯・布鲁斯（Louis Brus）首先发现了量子点胶体溶液。他现在是哥伦比亚大学化学系教授。在 1983 年和 1984 年发表的两篇论文中，布鲁斯将量子点描述为 “小型半导体微晶”。

量子点有着奇特的行为方式，尽管它们包含 100 到 10 万个原子，但它们表现出的性质就像它们由单个原子组成一样。当然，它们确实符合荧光基团的性质，即它们可以吸收光能并激发，然后在返回基态时释放光子。不过，量子点发射光线的波长取决于量子点的大小，即量子点越小，发射波长就越短。这种特性是因为较小的量子点具有较大的 “最小带隙”。这正是激发电子到更高能态所需的能量。由于较小的量子点需要更多的激发能量，它们随后会发射较短波长的光（波长与激发能量成反比）。

大约 20 年后，即 2002 年，加州量子点公司的生命科学研究人员实现了量子点的商用开发。

量子点是一种非常明亮且稳定的荧光工具。研究表明，量子点的的亮度比传统荧光基团高几个数量级，尽管与有机染料相比，量子点的明亮程度存在一些差异 [6]。就光稳定性而言，量子点的稳定性是传统荧光基团的 100 倍，在一项活体成像研究中，量子点的荧光持续时间长达 4 个月 [7]。

在传统荧光探针中，一个或多个荧光基团可以附着在单个相关抗体上。然而，由于量子点的表面积非常大，许多分子和抗体可以附着在单个量子点上，这会带来许多优点，包括荧光信号放大。量子点的使用也为多重分析提供了优势，可以在检测中同时对各种波长进行成像。在这种分析中，唯一的变量是研究者选择的量子点大小（因此发射波长）。可以使用白光同时激发大范围的量子点，这样就可以避免使用多道激光和多次调整来形成最终影像。

References

On the change of refrangibility of light; G. G. Stokes, M. A., F. R. S. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 1852 142, 463-562, published 1 January 1852
Luminescence in Hydromedusae D. Davenport; J. A. C. Nicol, Published 29 November 1955. DOI: 10.1098/rspb.1955.0066
Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 1962 Jun;59:223-39.; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13911999?dopt=Abstract
Green fluorescent protein as a marker for gene expression; Science 11 Feb 1994: Vol. 263, Issue 5148, pp. 802-805 DOI: 10.1126/science.8303295
Improved Green Fluorescence; Nature Volume 373, 23. February 1995
QDs versus Alexa: reality of promising tools for immunocytochemistry; Journal of Nanobiotechnology; http://www.jnanobiotechnology.com/content/7/1/4
Noninvasive Imaging of Quantum Dots in Mice; Bioconjugate Chem., 2004, 15 (1), pp 79–86 DOI: 10.1021/bc034153y; Publication Date (Web): December 30, 2003

数码显微镜摄像头和图像分析的基础技术术语定义

摄像头的特征通常决定了所采集到的图像是否能够揭示出研究人员希望观察到的现象。但深入到摄像头术语时，技术术语十分繁杂。我们汇总整理了最为重要的术语及其简明释意以便提供方向。这些术语按字母顺序排列。

像素合并（Binning）

像素合并是一种提高相机帧速率和动态范围的技术，同时可通过牺牲分辨率来降低噪声。这种技术通常用于高速荧光延时实验。相邻像素的数据会组合在一起并作为超级像素来读取，而不是读取每一个独立像素的数据。所使用的像素合并数值通常在 2x2 和 8x8 之间。请务必注意，2x2 的像素合并所生成的像素是原始像素大小的 4 倍。

像素合并效果取决于摄像头所用传感器类型，如下表所示。

	速度	数据容量	分辨率	SNR
CCD	↑	↓	↓	↑
EMCCD	↑	↓	↓	↑
CMOS	↔	↓	↓	↔
sCMOS	↔	↓	↓	↔

位深

摄像头传感器的位深阐述的是摄像头将来自像素阵列的模拟信号转换成数字信号的能力，通过灰度级或灰度值来表征。这是模数转换器的一种特性。位深越大，可输出的灰度值就越多，图像中可复制的细节就越多。

亮度

亮度描述的是影响个人或传感器的相对强度。就数字图像而言，强度是基于整个传感器当中进行平均计算获得的。

颜色查询表（CLUT）

数字图像由单个像素的阵列组成。这些像素的颜色信息可保存成数字代码，每一种颜色作为一个不同的数值存储。

颜色查询表是一种索引工具，所保存的这些数值主要以 RGB 色彩空间基础，常用于监视器的具象化表现。

针对具体应用来选择适当的颜色查询表取决于用户自己的判断和需求。但经验证明，特定颜色查询表对于某些特定应用尤为有效且实用。例如，CLUT “绿色” 通常用于记录用 Alexa 488、FITC 或其他类似荧光染料标记的样本，这些荧光染料都在绿色光谱范围内发射。另一方面，CLUT “红色” 则用于使用 TRITC、Texas Red、Cy3 或其他类似的荧光染料来进行染色的样本，可在红色光谱范围内发光。

“CMYK” 是一份特殊的颜色查询表，主要处理 CMYK 色彩空间且通常用于印刷系统的色彩输出。

色彩空间（RGB、CMY、CMYK）

在每一种成像系统（如，显示器、打印输出等）当中，任何颜色描绘都基于单个基本颜色的组合。成像方法通过加色和减色混合来加以区分。例如，在黑色显示屏上必须发射某种类型的光才能产生既定颜色。在这种情况下，光的类型以红绿蓝（RGB）为基础。

如果全部三种颜色都照亮则会生成白色。如果这三种颜色都被关闭则会生成黑色。人眼及数码相机和显示器都适应了 RGB 模型。

另一方面，印刷机使用了减色混合，因为在类似纸张的材料表面上，光必须从白色基材（纸张）上反射。因此，印刷机需要计算必须添加哪种墨水才能与白色基板结合以产生给定颜色。在这种情况下，青色、品红和黄色（CMY）的组合（红、绿、蓝的互补色）是光谱中所有其他颜色的基础。在这个模型中，添加全部三种颜色会形成黑色，而缺少全部三种颜色则会变成白色。

注：实际中，黑色使用单独的印墨来进行印刷以避免彼此叠加使用太多的颜色并获得更加生动的黑色印染表现。有鉴于此，色彩空间又被称为 CMYK，其中 K 代表轮廓版，这是一种特殊的黑色印刷设备。

反卷积

反积卷是一种通过运用数学算法在显微镜图像当中将离焦信息重新分配到原点的一项技术。通过反卷积处理，用户能够在特定聚焦平面上获得更加锐利的照片，而且感兴趣结构的 3D 成象更趋于真实。

保持时间

在共焦显微镜技术当中允许激光束在既定时间内扫描特定区域（相当于图像的像素尺寸）。该时间就被称为保持时间。合理地说，延长保持时间有助于光漂白并对样本形成压力。

动态范围

显微镜摄像头的动态范围提供了传感器可以同时记录的最低和最高强度信号的信息。对于低动态范围传感器，强信号会使传感器饱和，而微弱信号会在传感器噪声中丢失。大动态范围对荧光成像尤为重要。

曝光时间

数字摄像头的曝光时间决定了摄像头芯片暴露接触样本光线的持续时间。根据光强度的不同，对于大多数成像应用来说，这个时间通常从数毫秒至数秒不等。

增益

数字摄像头将光子数据转换成数字数据。该过程中来自传感器的电子会经过预放大器。增益就是对图像传感器的信号实施放大处理。应当注意到，放大处理不仅会增强信号，同时也会让噪声一并增强。

伽马（校正）

人眼对光线的感知是非线性的。我们的眼睛无法感知到两个光子比单个光子的亮度高两倍；我们只能感知出两个光子比一个光子更亮一些。和人眼不同，数字摄像头对光的感知是线性的。两个光子的信号量就是一个光子的两倍。伽马值则可看作是人眼和数字摄像头之间的一种联系。

这可以用以下公式表示，其中 Vout 是输出（检测到的）亮度值，Vin 是输入（实际）亮度值：

Vout = Vingamma

通过改变伽马值 – 即进行伽马校正处理 – 就可以借助线性记录相机拍摄的数字图像适应人眼的非线性感知。这种校正处理绝大多数摄像头芯片都可以实现。此外，数字成像软件通常也有自己的伽马校正选项。

光强

光强是对能量级别的描述。在光学领域，辐射强度用以描述物体在一定时间和区域内发射的光能的数量。

噪声

噪声是所有测量中固有的不良特性。噪声是科学成像中关注的主要问题之一，毕竟噪声会影响到人们对感兴趣的信号进行量化的能力。成像时需要考虑的最重要参数是信噪比，即图像中的噪声与要采集的信号量的比值。噪声可分为以下几类：

光学噪声：通常由高背景染色引起的有害光信号，导致样本制备不良或样本高自发荧光。

暗噪声：电子在传感器中的热迁移，与积分长度成正比。暗噪声可以通过冷却成像传感器或缩短曝光时间来克服。

读取噪声：电荷从摄像头传感器内读出时引发的一种电噪声源。要减少读取噪声，可以减慢传感器读出速度，即减少最大可实现的帧速，或者换为更先进的传感器类型，即 EMCCD 和 sCMOS 传感器。

光子散粒噪声：由光子撞击传感器的随机性质引起的任何光信号中固有的噪声。这只在非常弱光的应用中被关注。采集更多的信号可以减少散粒噪声对图像的影响。

改善信噪比的最简单方法是通过延长积分计算时间或者增加照明强度来收集更多信号。这些方法并不总是可行，此时就需要使用更低噪声的摄像头。

Nyquist 定理

显微镜中的成像是指从样本信号到数字图像的采样处理过程。Nyquist 定理描述了采样处理的重要法则。

原则上，重现精度会随着采样频率的提高而增加。

Nyquist 定理当中指出，采样频率必须大于输入信号带宽的两倍才能根据采样数据重新建出原始输入。对于数字摄像头而言，这主要体现在像素大小上。为获得最佳结果，像素应该始终比您要解析的最小结构还要小三倍，或者换句话说，每个可解析单元最好包含至少 3 个像素。

像素

摄像头中的像素是传感器的基本感光单元。这适用于所有二维阵列传感器，包括 CCD、EMCCD、CMOS 和 sCMOS 的显微镜摄像头。传感器上的像素数是一个经常被引用的单位，即 500 万像素的相机有 500 万像素。像素数量经常与传感器的分辨率混淆，因为不同传感器类型的单个像素的大小可能会有很大的差异。

量子效率（QE）

传感器的量子效率指传感器的灵敏度。量子效率描述了给定波长之下光子击中传感器而转换成电子的百分比。QE 曲线在不同波长之下存在差别。

RGB / 灰度直方图

图像上的每个像素都有特定的灰度值。灰度值范围从纯黑色（0）到纯白色（8 位色深为 255，12 位色深为 4095 等）。

直方图中显示了灰度值在感兴趣区域（ROI）内的分布，即各灰度值所确定的像素数量且结果用曲线表示。

在直方图的帮助下，如摄像头曝光时间等多种设置均可获得优化。X 轴上灰度值的平滑分布表明摄像头的动态范围获得最佳利用。

线型曲线图（Line Profile）

该工具用于对感兴趣区域（ROI）沿着线性来测量灰度值，以图形方式将灰度值显示成曲线并对其开展统计处理。

堆栈曲线图（Stack Profile）

该工具用于对感兴趣区域的面积（ROI）沿着面来测量平均灰度值，以图形方式将灰度值显示成曲线并对其开展统计处理。

饱和度

数字摄像头的基础工作原理是光子击打光电二极管产生电子，然后对电子进行收集、移动并最终转换成数字信号。考虑到电子的转移，其存在着两处瓶颈（CCD 摄像头）：

单个光电二极管的电荷容量（满并容量)
摄像头芯片的最大电荷传输容量

如果超过其中任何一个，相机将无法处理额外的信息，从而导致数码图像中出现伪影（如散光）。

注：LAS（Leica 套装应用软件）X 软件当中的查询表（O&U）可帮助控制饱和度。

显微镜摄像头的传感器类型（CCD、EMCCD、CMOS、sCMOS）

CCD 显微镜摄像头：基于充电耦合装置（CCD）传感器的显微镜摄像头主要应用于明场和基础的荧光成像技术。与其他数字摄像头传感器一样，其单个像素在光线照射下产生电荷，最终转化为数字信号。与 CMOS 类型传感器相比，只有单一输出节点会在 CCD 传感器当中用于数据收集。

EMCCD 显微镜摄像头：简单来说，EMCCD（电子倍增电荷耦合器件）传感器是一种配备额外专用 EM 增益寄存器的 CCD 传感器。该寄存器安装于传感器和读出电子元件之间，负责信号放大。此外，EMCCD 传感器还可以是背照式的传感器，一般峰值量子效率可超过 90%。尤其是在极端低光照的应用当中，EMCCD 摄像机的使用能够获得较大的收益。

CMOS 显微镜摄像头：互补金属氧化物半导体 CMOS 相机最初用于手机和低端摄像头。随着这种技术的不断完善，CMOS 显微镜摄像头变成了标准明场显微镜的主流成像设备。不同于 CCD，CMOS 摄像头特有像素内电子元件。由于传统 CCD 传感器只是用单一读取节点，因此相比之下 CMOS 数千个读出节点的工作原理更有助于节省时间。

sCMOS 显微镜摄像头：科学 CMOS 摄像头 – 或 sCMOS 摄像头 – 从 CMOS 显微镜相机演变而来。专门适应满足科研需求的这类型传感器没有 CMOS 传感器中常见的缺点，如噪声水平偏高和均匀性不理想。其较快的帧速、较高的动态范围以及较低的噪声可完美支持高端荧光成像应用。