克隆需要验证_菜鸟学习之旅(一)——无缝克隆(上)

最近开始了分子生物学中质粒设计和构建实验，其中设计到无缝连接克隆，正好借着这个机会温故和知新，一只小菜鸟的学习之旅开始了。

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一. 最最最基础的PCR反应

聚合酶链式反应(PCR)是基于碱基互补配对原则，通过温度的变化去控制DNA复制的三个主要步骤：变性，退火和复性。下面图1是最基础的PCR扩增循环示意图。

图1. PCR基础扩增过程(三步法) 来自https://www.takarabiomed.com.cn/

Step1 DNA热变性，使得DNA解旋成单链结构；

Step2 退火，使得单链DNA与引物通过碱基配对的原则结合；

Step3 延伸，在DNA聚合酶的作用下，沿着引物3'端合成互补链 (也有将退火和延伸并为一步的去减少反应时间)

Step4 再次进行循环，一般循环25-35次。

而要做好准确并且高效的扩增就需要注意以下两点：

1. 最重要的引物设计

引物设计经常被要求注意的就是GC含量40-60%；长度一般在20bp左右；Tm在60°C左右；3'端不超过2个G/C；避免形成二聚体结构/发夹结构。而5'端要求相对松一些，可以添加酶切位点，重组序列