克隆需要验证_基因克隆

PubMed-Gene搜索需要克隆的基因

找到CDS区域，注意有的基因有很多isoform, 但大部分isoform的CDS区域相似，找常见或表达量较高的，或根据自己实验需要特定的isoform找到基因的CDS区域序列

打开SnapGene 软件-new DNA file, 粘贴CDS序列

分析其酶切位点

同时找到自己需要克隆载体的序列，分析多克隆位点（multiple cloning site, MCS）包含的酶切位点

找到MCS有的，而且不包括在克隆片段中的酶切位点

Kpn1 Acc65I BamHI NotI Xhol BstBI

按照在质粒的先后顺序，选择两个酶切位点https://www.neb.com/-/media/nebus/files/chart-image/cleavage_olignucleotides_old.pdf?la=en 或者https://wenku.baidu.com/view/0fb0ca1cb7360b4c2e3f644d.html?re=view 此网站有各个酶切位点应该选择的碱基情况

注意选择酶切效率高的位点

Kpn1 GGGGTACC

BamHI CGGGATCC

NotI ATAAGAATGCGGCCGC 这个必须20h以上酶切效率才能达到90%

Xhol CCGCTCGAG 20h只有75%

BstBI CTGCAGAACCAATGCATTGG 20h 90%

注意两个酶切位点不能选择切除后相同的回文序列，否则无法连接

选择合适的连个酶切位点后，评估所用buffer

https://nebcloner.neb.com/#!/redigest

注意所选酶是HF酶还是普通酶，带星号表示不可用

选择合适的双酶切系统后，设计引物,注意Vector的标记tag如果没有独立的启动子，则不应该将末尾3位终止密码子碱基克隆进去。

F：GGGGTACCGCCACCatgggccagactgggaagaaatc （KPNI）5-3

R: gcatcgaaagagaaatggaaatccctGGATCCGC (BamHI) 3-5

R: GCGGATCCagggatttccatttctctttcgatgc 5-3

2 PCR扩增目的基因

Mix（Thermo Phusion Master with HF）

7.5ul

2.5ul

DDW

6ul

19 ul

Primer（F+R, 浓度为5uM）

1

5

质粒＞10ng，cDNA50-100ng

0.5ul

1

15ul体系

50ul体系

4. 酶切载体和PCR产物

PCR回收产物

34ul

Vector：1ug/浓度＋DDW＝34ul

Enzyme1

1ul

1ul

Enzyme2

1ul

1ul

10x smart cut buffer

4ul

4ul

40ul体系

40ul

37℃酶切过夜

5. PCR目的基因纯化

50ul体系加50ul DDW

100ul Binding buffer

Maximum 离心1min

700ulwash buffer

Maximum 离心1min

再Maximum 离心1min

35ul DDW洗脱

至于Vector则需要跑胶后根据质粒大小片段回收。

6.计算链接体系

PCR(ng)=7x30xPCR长度/载体大小长度

PCR:Vector 摩尔数之比大概1：7

连接体系

T4 ligase NEB M202s

1ul

10x T4 ligase buffer

2ul

DDW+PCR产物

7ul

Vector

Y ul (100ng/n)

20ul

酶切连接，室温＞2h，最好16℃酶切过夜

T4说明书

COMPONENT

20 μl REACTION

T4 DNA Ligase Buffer (10X)*

2 μl

Vector DNA (4 kb)

50 ng (0.020 pmol)

Insert DNA (1 kb)

37.5 ng (0.060 pmol)

Nuclease-free water

to 20 μl

T4 DNA Ligase

1 μl

夏云方案：（xxx ug * 10e6） / （660pg * bp数）=xxx pmol

Vector 摩尔数 0.03 pmol（固定）0.03x0.6xVector（kb）/浓度（ng/ul）

DNA 摩尔数 乘以7

7. 转化

之后挑单克隆，摇菌（5ml 4管）,12-16h后提取质粒

8. 跑胶验证质粒大小 140v 40min, 1-2％琼脂糖凝胶

1.正常质粒大小

2.酶切质粒

9. 测序，序列正确可以储存菌液 -80℃ 500ml菌液+500ml 40％ glycerol 1：1稀释，终浓度为20％

PCR测序取的样本量

1-500bp

取1-10ng

500-1000bp

取5-20ng

1-2kb

取10-40ng

＞2kb

取10-40ng

Plasmid测序取的样本量

1-5kb

取150-300 ng

Big size

取500-750 ng

DNA/plasmid

取约200ng体积

单引物（5uM）

1ul

DDW

总体系

6ul

注意测序大小只有600-800bp，如果测序片段较大，需要前后不同引物各测序一次

10 转染

11. qPCR及WB验证目的基因是否过表达