ctab提取dna流程图_新型快速中药材DNA提取方法的探索与应用

随着蕲蛇^[1]、乌梢蛇^[1]、川贝母^[2]的特异性分子鉴别方法引入《中国药典》2010、2015年版，分子鉴定法成为中药鉴定工作中的一大发展趋势，其高特异性、高灵敏度的优点也日益呈现。核酸的提取是中药分子鉴定中必不可少的步骤，但由于中药材多为干品，其DNA降解严重且富含大量的次生代谢产物，相对于新鲜样品往往更难提取^[3-4]。传统的DNA提取方法如CTAB法^[5]、试剂盒法^[6]等往往耗时长、操作复杂繁琐，严重制约了分子鉴定方法的使用和推广。简便、快速的DNA提取方法一直是分子生药学研究者追寻的目标，尽管现有的快速提取方法如碱裂解法^[7]、直接PCR法^[8]等可将提取时间缩短至10 min左右，但这些方法仍需要加热、离心沉淀等操作，具有一定的局限性。

滤纸纯化法由Zou等^[9]报道，利用Whatman NO.1等富含纤维素的试纸可以在30 s内从植物、动物和微生物中快速地完成核酸的提取和纯化，不需要任何实验仪器，操作十分简便。基于中药现场、快速分子检测的构想，本研究首次将滤纸纯化法用于中药材的DNA提取并结合DNA条形码检测、《中国药典》2015年版收载的分子鉴定等研究，探索其在中药材DNA提取和分子鉴定中的可行性，从而建立一种无设备快速提取中药材DNA的方法，为中药分子鉴定技术的发展和普及提供技术支持。

1  材料与仪器

1.1  材料

材料分别采集自广州中医药大学药圃、或购买于药材公司及网络，样品均由广州中医药大学吴文如副教授鉴定。新鲜样品保存于−80 ℃冰箱，干燥样品保存于−20℃和4 ℃冰箱。样品信息见表1。

1.2  仪器与试剂

BSA224S电子分析天平(日本ViBRA 公司)；Water Bath SY-1210恒温水浴锅(美国Crystal公司)；水平电泳仪(美国BioRad公司)；T100梯度PCR仪(美国BioRad公司)；Nano Drop2000超微量紫外分光光度计(美国Thermo公司)；Tanon 2500凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)。

聚乙烯吡咯烷酮40(PVP 40)购自Amresco公司；Triton X-100购自Sigma公司；植物组织直接PCR试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；新星牌定性滤纸购自杭州富阳特种纸业；石蜡购自莱卡公司；扩增试剂(PrimeSTAR HS Premix)购自宝生物工程(大连)有限公司；低熔点琼脂糖，5