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9)加入等体积氯仿/异戊醇,颠倒混合,以进一步抽提提取液中含有的蛋白质,并萃取出其中的酚(酚在水中有一定溶解度);
10)12,000~13,000rpm离心10~15min,将上清转移到新管中,仍旧要注意不要触动中间的蛋白质层;
11)向上清中加入0.6倍至等体积异丙醇,彻底颠倒混匀,使DNA从溶液中析出,形成絮状沉淀;
12)用玻璃棒或枪头挑出DNA沉淀,放到已经加入70%酒精的1.5ml Eppendorf管中,颠倒管子几次,以洗涤DNA,溶解其中含有的色素等物质;
注:a 70%酒精如果为新配制的,则一定要将酒精和水彻底混匀,否则会使提取的DNA被溶解很多,必须注意!在其他实验中也是如此;
b 在这一步中,可以用70%酒精洗1~3次,每次5~15min,具体如何要根据提取的DNA 的情况决定,目的就是尽量洗掉DNA沉淀中的色素,尤其在提取叶片的DNA时容易有色素(叶绿素等);
13)稍离心,倒出管中的酒精,并用枪将剩余的液体尽量吸净,真空浓缩仪干燥之后,向管中加入适量TE缓冲液溶解DNA;如果DNA溶解困难,可以用50~60℃水浴助溶;
注:此时得到DNA粗提产物;
14)DNA溶解后,向其中加入RNase至终浓度50~70µg/ml,混匀,37℃水浴30min,除去RNA;
15)加入等体积氯仿/异戊醇,颠倒混合,变性溶液中的蛋白质;
16)12,000~13,000rpm离心10~15min,将上清转移到新管中;
注:在转移上清时,有时候部分DNA会因为含有的多糖杂质过多而比较粘稠(尤其在提愈伤组织的DNA时容易出现这种现象),为了避免将这部分DNA吸取出来,可以采用以下的方法:
将枪尖伸入Eppendorf管底部,吸尽下层的氯仿/异戊醇,然后12,000~13,000rpm再次离心10min,这样,带有多糖的DNA以及其他的沉淀会被集中到管底,与溶解良好的DNA溶液区分明显,此时再用枪取上层的DNA溶液就比较容易了;
17)加入1/10体积3M NaAc(pH5.2),混匀后加入2倍体积无水乙醇,颠倒混匀,沉淀DNA,可以在-20℃放置30min~2小时促进DNA沉淀(这一步可以在-20℃中过夜);
18)12,000~13,000rpm离心10min收集DNA沉淀,弃上清,70%酒精稍作洗涤,尽去70%酒精(也可再离心,然后丢弃上清),真空浓缩仪抽干,加入适量超纯水溶解备用或不溶解而直接以干的状态置于-20℃保存;