引物设计软件primer_『i实验』PCR专题: 手把手教你用NCBI进行在线引物设计及验证...

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通常,我们在设计引物时要遵循以下3个步骤:

  • 基因查找
  • 引物设计
  • 引物验证

现在,我们就以常见的肿瘤TP53基因为例来演示这一过程。

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TP53是一个常见的抑癌基因,在较高比例的实体瘤患者中都发现了该基因的突变。其编码的蛋白具有调控细胞分裂、增值的功能。

首先,我们打开NCBI网站,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 选择数据库,此处我们选择“Gene”数据库,并输入要查找的基因名称(Gene Symbol)

Gene Symbol是基因的名字,每个基因的Gene Symbol是固定的,搜索时应该分辨出常用名和Gene Symbol。准确的Gene Symbol可以使我们快速地检索到目标基因。

例如,当我们输入该基因的Gene Symbol “TP53”时,页面中可以很快地显示出我们需要的结果:

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而当我们输入该基因平时的常用名“p53”时,则会出现相对模糊的搜索结果:

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我们在这里需要注意的是,当选择的数据库不同时,搜索结果会略有差别。例如,选择不同的数据库Gene和nucleotide时,搜索TP53的界面如下:

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引物设计是分子生物学实验中的一项重要工作,它涉及到PCR扩增、基因克隆、基因组重测序等多个实验步骤。在实验中,引物设计需要考虑多个因素,如引物长度、引物的温度、引物的碱基组成等。 Linux系统提供了多种引物设计软件,其中比较常用的是primer3软件。下面我们将详细介绍在Linux系统中使用primer3进行批量引物设计的方法。 首先,需要安装primer3软件。在Linux系统中,可以通过以下命令进行安装: ``` sudo apt-get install primer3 ``` 安装完成后,我们可以使用primer3_core命令进行引物设计。具体命令格式如下: ``` primer3_core < input_file > output_file ``` 其中,input_file为输入文件,output_file为输出文件。下面我们将详细介绍输入文件的格式。 输入文件包括多个引物设计任务,每个任务由以下几行组成: ``` SEQUENCE_ID=task1 SEQUENCE_TEMPLATE=ATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCG PRIMER_TASK=pick_pcr_primers PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=100-200 = ``` 其中,SEQUENCE_ID为任务名称,SEQUENCE_TEMPLATE为待扩增序列,PRIMER_TASK为引物类型,PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE为扩增产物长度范围。每个任务以“=”符号结尾。 下面是一个输入文件的例子: ``` SEQUENCE_ID=task1 SEQUENCE_TEMPLATE=ATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCG PRIMER_TASK=pick_pcr_primers PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=100-200 = SEQUENCE_ID=task2 SEQUENCE_TEMPLATE=CGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGAT PRIMER_TASK=pick_pcr_primers PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=150-300 = ``` 在输入文件中,可以设置多个任务,每个任务的引物设计结果将输出到输出文件中。 使用以上命令进行引物设计后,输出文件中会包含每个任务的引物设计结果。输出文件的格式如下: ``` PRIMER_LEFT_0_SEQUENCE=ATCGATCGATCGATCGATCG PRIMER_RIGHT_0_SEQUENCE=CGATCGATCGATCGATCGAT PRIMER_LEFT_0=20,5 PRIMER_RIGHT_0=45,5 PRIMER_PAIR_0_PRODUCT_SIZE=150 PRIMER_LEFT_1_SEQUENCE=ATCGATCGATCGATCGATCG PRIMER_RIGHT_1_SEQUENCE=CGATCGATCGATCGATCGA PRIMER_LEFT_1=21,5 PRIMER_RIGHT_1=44,5 PRIMER_PAIR_1_PRODUCT_SIZE=149 ``` 其中,PRIMER_LEFT_0_SEQUENCE和PRIMER_RIGHT_0_SEQUENCE分别为左侧和右侧引物的序列,PRIMER_LEFT_0和PRIMER_RIGHT_0分别为左侧和右侧引物的起始位置和长度,PRIMER_PAIR_0_PRODUCT_SIZE为扩增产物的长度。每个任务的引物设计结果以编号“0”开始。 总结一下,在Linux系统中使用primer3进行批量引物设计的步骤如下: 1. 安装primer3软件。 2. 准备输入文件,设置任务名称、待扩增序列、引物类型和扩增产物长度范围。 3. 使用primer3_core命令进行引物设计,输出结果保存在输出文件中。 4. 解析输出文件,获取每个任务的引物设计结果。 希望这篇文章对你有所帮助!

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