拷贝依赖_【bionumerics应用06】多重连接依赖性探针扩增（MLPA）分析

多重连接依赖性探针扩增（MLPA）分析

MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。

多重连接依赖性探针扩增（MLPA）分析

多重连接依赖性探针扩增（MLPA）是MRC-Holland的注册商标，是一种相对简单且成熟的多重PCR方法，用于检测多个靶标中的染色体DNA拷贝数变化。

顾名思义，探针的扩增取决于连接步骤，只有在样品中存在目标DNA时才会发生。这可以如下实现。对于短序列的目标DNA，设计了两个相邻的探针，分别包含正向和反向引物序列。另外，两个探针都包含一个填充序列，其长度可以根据实验的功能而变化。将探针与目标DNA杂交，然后连接。仅在发生连接时，功能性PCR链才会出现，因此扩增仅在样品中存在目标DNA时发生。PCR产物的量与样品中存在的目标DNA的量成正比，这使得该技术适用于定量测量（相对倍性）。汇集多个探针对，并用相同的引物对扩增，因此该技术不受多重PCR的常见限制影响。

正向引物经过荧光标记，因此可以使用毛细管电泳观察扩增子。

填充序列的长度不同，因此一次实验最多可以扩增和分离50个靶标。

BioNumerics中的MLPA分析

BioNumerics MLPA插件提供了用于MLPA可靠分析的全自动工作流程。通过其丰富的集成环境，BioNumerics提供了许多其他软件工具无法提供的功能：

• 强大的数据库基础，包括用户和安全功能以及可选的符合最高标准的审计跟踪。
• 一个用于分析MLPA以及许多其他技术，例如HDA / CSCE，TaqMan SNP分析，微卫星，序列分析等的平台。
• 从原始数据导入到报告结果和问题跟踪都能够实现自动化。此外，该软件可使用Python进行完全脚本化，以实现任何程度的定制。因此，BioNumerics非常适合高通量分析。
• BioNumerics提供了多种数据挖掘、分析和统计工具，可对大型数据集进行聚类、统计分析和假设检验。

导入和处理曲线数据

BioNumerics MLPA插件提供了用于自动处理MLPA图谱的工作流程，包括从原始测序图谱文件或预处理的峰表（Applied Biosystems和Beckman）开始。可以组合多个混合探针，对于每种混合探针，可以首先在软件中输入MLPA设置。这包括染料设置、自动命名和信息解析以及所用尺寸标准的选择。

MLPA实验的设置

MLPA插件允许使用MRC Holland提供的格式导入混合探针。对于现有的混合探针，可以添加、删除或编辑探针。在设置中，也可以创建新的自定义混合探针。

可以编辑默认的评分类别：未定义、不存在、丢失、正常、增加和扩增。由于评分的自动分配依赖于标准化和与已知参考样本的比较，因此对照样本的存在非常重要。MLPA插件使用具有已知异常的负控制（所有正常）和正控制。

自动分配和评分

样品中的峰会根据混合探针物定义中提供的尺寸信息自动分配给已知探针。根据仪器的不同，某些探头可能需要在“观察尺寸”和“理论尺寸”之间进行一次校正。该插件提供了根据所有观察到的峰的中心位置重新定义探针大小的功能。

该插件利用迭代算法在二维上对峰高或峰面积进行归一化：（1）图谱中的所有峰（中值，均值，线性或指数）；（2）所有样品中的同一峰（中值，均值和最小值） ）。可以从标准化的定量或剂量商计算出峰得分。可以根据在染色体上出现的形式对评分的探针进行分类，以便轻松评估潜在的大片缺失或重复，如图所示（右图）。

如果手动检查指示需要调整评分参数，则设置对话框将允许使用不同的评分策略并调整损失-收益值。 所有设置都可以保存到分析模板中。

可以在探针图分布窗口中获得所有探针一起或每个探针单独定量分布的更深入分析。可以将图统计信息保存到设置中，以实现更准确的自动评分。

可以使用“质量控制”窗口监视实验的质量，该窗口允许检查运行或选择样品各种参数。 用户可以设置“好/坏”指示的阈值。

最后，可以为数据库中选定样品的所有探针生成详细的报告。可以选择要显示的信息和属性。

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