如何在细胞间做细胞实验？

更换培养液

我们使用的MEM培养中带有酚红指示剂来反应细胞培养中的pH情况，其中培养液的颜色为红色时表明培养的pH大于7.4，适合于绝大细胞的生长（当然这也包括HaCaT细胞），由于细胞培养过程中代谢废物的产生以及在CO2培养箱中CO2的溶解，培养液的pH会不断的下降，当指示剂中颜色变为橙色时，培养液的pH大约为7.2，细胞基本停止生长，当培养液的颜色变为黄色时，其pH则小于7.2，不利于细胞生长甚至容易发生细胞的死亡。培养液的颜色变化幅度不是恒定的，因为其受到培养瓶中细胞数目的影响，培养瓶中细胞密度低时个体代谢废物少，颜色变化慢；密度高时则相反。但是细胞培养瓶中细胞浓度低时，往往时刚完成复苏或者传代，这时培养液中会含有一定量的死细胞也需要更换培养液，所以基于上述和经验，HaCaT细胞往往需要2-3天就必须要更换一次培养液。
更换培养液时将细胞培养瓶从CO2培养箱取出，置于显微镜下观察细胞状态，检测是否有杂质或者细菌的污染，倒出或者吸出旧培养，同时注意瓶口不要带有培养基或者其他液体残留，否则容易造成污染，如果瓶口有残留的液体一定要用枪头吸干。加入2-3 mL的PBS（不含Ca2+和Mg2+）清洗一到两遍，然后重新加入4-5 mL的完全培养基，置于显微镜下再次观察细胞状态。换液操作过程中动作越快越好，以避免细胞长时间暴露在无液体的环境中造成细胞死亡。

细胞传代

细胞生长到一定程度时会发生接触抑制而暂停生长，HaCaT是贴壁生长的细胞，当细胞生长到铺满整个培养瓶且显微镜下观察已经看不到细胞之间的间隙时，就必须进行细胞的传代，否则可能会引起细胞大面积的死亡甚至生长形态的改变。
传代时也将细胞培养瓶从CO2培养箱取出，置于显微镜下观察细胞状态，检测是否有杂质或者细菌的污染以及生长的密度是否可以传代，倒出或者吸出旧培养，加入2-3 mL的PBS（不含Ca2+和Mg2+）清洗一到两遍，加入3-4 mL的胰蛋白酶溶液消化细胞。置于显微镜下随时观察细胞的消化状况，期间可以适当拍打瓶壁使细胞脱落下来，当细胞都从瓶壁上脱落下来，肉眼就可以观察到瓶壁上的白色物质全部悬浮可以认定细胞基本消化完全。一般一瓶T25瓶铺满的HaCaT细胞在室温下（24℃左右）需要10-12min的时间消化完全，也可以通过提高胰酶的浓度（浓度而不是用量）或者擦拭干净后放入培养箱中加速消化来加快消化过程，消化的时间不能过长也不能过短，过长胰酶会消化细胞使细胞损伤，过短则不利于后续传代和细胞的分离。认定消化基本完成时向培养瓶中加入1-2 mL的完全培养基，因为完全培养基中有血清可以抑制胰酶的作用以结束消化，同时吸打混匀细胞悬液，1000 rpm离心2-3min，弃去上清，加入4 mL完全培养基（按照推荐为1：3传代），根据经验1：3传代往往过多，按1：8或者1：10传代较为合适，即大约吸出0.5 mL加入到新的培养瓶中，在细胞悬液加入新的 培养瓶之前先加入4-5 mL完全培养基，防止细胞已经贴壁无法分散到培养基中，加入培养基和细胞悬液时都加入到瓶的底侧，不要打到瓶底部和上侧，置于显微镜下再次观察细胞状态，细胞数目合适且多为单个细胞则是一次比较成功的传代，如不然则需调整加入细胞悬液的体积及消化时间。

细胞冻存

按照细胞培养的说明书配制细胞冻存液，HaCaT细胞使用含20%的FBS及8%的MEM 培养基作为细胞冻存液，我们直接使用碧云天公司已经配好及进行优化的细胞冻存液进行细胞冻存，推荐比例为＞106及以上的细胞使用约1 mL的细胞冻存液，实际操作中大致按照传代比例进行冻存，即一瓶长满的T25培养瓶大约冻存3管细胞。
细胞冻存操作与传代操作基本一致，只有后面加入的完全培养基更换为细胞冻存液，放入专门的冻存管中和专门的冻存盒中在-80℃冰箱中保存。