RNA-seq的典型流程（protocol）

一、RNA的分离

从新鲜的或者是冷冻的细胞或组织样本中分离RNA，一般情况下，样品会被DNA污染。因此，在制备文库之前，会使用DNA酶（降解DNA）降解RNA样品中的DNA污染。

二、RNA的质量检查

（在后续分析的时候也有质控这一步，不过是从测序质量这个层面的质量）

在制备文库之前，要在RNA降解，纯度和数量上对RNA进行质量检查。

三、文库制备

由于DNA相较于RNA有更好的稳定性，所以在测序前，需要将RNA转化为cDNA。

RNA-seq常用的illumina平台的文库制备流程：

（1）获得1~10ug纯的，完好，质量合格的总RNA。

（2）将总RNA退火到寡核苷酸单链，经过两轮纯化，去除非特异性结合的核糖体和其他RNA。

（3）利用片段化试剂使纯化的mRNA片段化。

（4）给片段化的mRNA加上引物。

（5）逆转录mRNA，产生cDNA。

（6）合成双链cDNA。

（7）纯化cDNA，去除可能的游离的核苷酸，酶，缓冲剂。

（8）cDNA末端修复，并纯化。

（9）将双链cDNA的3’端转换成腺苷酸。

（10）将接头连接到双链cDNA的两端。【接头就相当于是每个文库的标记，也就是说这个样本所提取到的RNA是这个标签，可用于后期合并测序的时候追溯样本来源】

（11）继续纯化，连接了接头经过末端修复的ds cDNA。

（12）使用PCR扩增来富集文库，使用来自接头的序列作为引物，扩增已经存在的序列。纯化。文库制备完成。

（13）对文库进行验证和质量控制。

• 通过PCR有选择的扩增应该存在于文库中的特异性基因。
• 量化文库中的双链cDNA产物。
• 通过聚丙烯凝胶电泳，可视化文库的丰度和大小分布。