NCBI引物设计流程

NCBI后台引物设计依托于Primer5

网址：National Center for Biotechnology Information (nih.gov)

详细操作如下：

打开主页后，选择Gene，然后在后面输入目的基因名，基因后面可以加空格然后加种属缩写，不知道种属缩写也可以不加

点击Search

找到目的基因，注意后面标记的种属，然后点基因名

进入下一页面后，向下拉，直到mRNA and Protein，点击红框内数字

向下拉

复制序列，然后另打开NCBI主页，点红框内Blast

向下翻到specialized blast，点Primer-Blast

注意为FASTA sequence，因此在第一行键入>ACTB（ACTB为目的基因名），然后回车，粘贴刚刚复制的序列

将上图红框内数字改成下图数字

继续

上图红框内可以选上，但如果选上得不到结果，就可以不选。以上两步都是为了防止DNA污染。

其它都可以不改，然后点Get Primers

需要运行几十秒，得到10对引物后进行选择，最好GC百分比在45%-55%之间，Tm在60℃左右。