水体浮游植物叶绿素a含量的测定

实验简介

        叶绿素a是估算浮游植物生物量的重要指标。浮游植物叶绿素a的测定方法较多，目前大多采用 Lorenzen 提出的单色法，此法只测定叶绿素a，并对脱镁叶绿素a的干扰进行了校正。通过实验，学习用热乙醇法对不同水体浮游植物叶绿素a含量的测定方法。必做实验，6学时。

一、实验目的

        通过对不同水体叶绿素a含量的测定，了解水生生态系统浮游植物生物量的估算方法，进一步认识浮游植物在水体生态系统生产中的重要地位。

二、实验原理

        浮游植物的主要光合色素是叶绿素(Chlorophyll)，常见的有叶绿素a、b 和c。叶绿素a存在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1～2%，是估算浮游植物生物量的重要指标。浮游植物叶绿素a的测定方法较多，主要有高效液相色谱法（HPLC法）、分光光度计法和荧光光度计法三种。高效液相色谱法能精确测定各种光合色素的含量，但仪器昂贵，分析操作步骤繁琐。荧光法具有较高的灵敏度，但需要荧光光度计等设备。分光光度法又分为三色法和单色法两种。过去通常采用三色法，但由于结果计算较粗，误差大，现已较少采用。目前大多采用 Lorenzen 提出的单色法，此法只测定叶绿素a，并对脱镁叶绿素a的干扰进行了校正。根据萃取溶剂不同 Lorenzen 单色法又分为丙酮法和乙醇法，我国多年来一直使用丙酮法。近年来国际上从萃取效果、安全和保健等考虑，已逐渐改用乙醇法。

三、实验用品

        721型分光光度计（或同类产品）、抽滤器（47mm不锈钢或有机玻璃抽滤器）、真空泵、医用离心机、可调节控温水浴锅、温度计、冰箱、醋酸纤维滤膜（直径47mm孔径0.45微米）、90%乙醇，1mol/L盐酸、10 ml离心管，250ml玻璃三角瓶。

四、实验操作

        1．按浮游植物采样方法采集水样。在抽滤器上装好醋酸纤维滤膜（或玻璃纤维滤纸）。取合适体积水样（一般湖泊、水库取样500ml，池塘250ml）经滤膜过滤后，将带样品的滤膜向内对折，放入10 ml离心管，保存于冰箱冷冻室，若置于低温冰箱（-20℃）中，则可较长期（三个月）保存样品。

        2．取250ml玻璃三角瓶装适量90%的乙醇在控温水浴锅中预热，水浴温度为80～85℃（每个样品约需12ml乙醇）；带样品的滤纸必须经过冰箱冷冻室冷冻12h以上或过夜，取出后立即加入8ml左右热乙醇，于80℃热水浴萃取2min，再将样品放到室温下避光处静置萃取4～6h，最长不超过12h。然后用3000～4000转/分离心10min（或用25mm玻璃纤维滤纸过滤）萃取液得清液，并用90%的乙醇定容至10ml。

        3．将上述10ml萃取液在721或752型分光光度计上，用90%的乙醇作参比，用1cm厚的比色皿于波长665nm和750nm处测吸光值，然后在样品比色皿中加入1滴1mol/L盐酸酸化，加盖摇匀，1min后于波长665nm和750nm处再测吸光值。

五、结果

        结果计算公式为：

        Chla = 27.9 *V乙醇[ (E 665 − E 750) − (A 665 − A 750) ] / V水样

        其中，Chla为乙醇法测定的叶绿素a浓度(μg/L)，E 665为乙醇萃取液于波长665nm的吸光值，E 750为乙醇萃取液于波长750nm的吸光值，A 665为乙醇萃取液酸化后于波长665nm的吸光值，A 750为乙醇萃取液酸化后于波长750nm的吸光值，V乙醇为乙醇萃取液的体积(ml)，V水样为水样过滤的体积(L )。

六、注意事项

1．水样过滤和冷冻保存应避免接触酸性物质，所有器具要避免酸污染。

2．在操作时必须严格控制水浴温度(80℃) 和热萃取时间(2min)，防止过高温度破坏叶绿素a而影响测定结果。

七、参考文献

[1] 黄祥飞主编. 湖泊生态调查观测与分析. 北京：中国标准出版社，2000.

[2] 陈宇炜，高锡云. 浮游植物叶绿素a含量测定方法的比较测定. 湖泊科学，2000，12（2）：185～188.

[3] 陈宇炜，陈开宁，胡耀辉. 浮游植物叶绿素a测定的“热乙醇法”及其测定误差的探讨. 湖泊科学，2006，18（5）：550～552.

[4] Human activities determine quantity and composition of dissolved organic matter in lakes along the Yangtze River. Water research. 2020.

[5] Mutual promotion of submerged macrophytes and biofilms on artificial macrophytes for nitrogen and COD removal improvement in eutrophic water. Environmental pollution. 2021.

[6]  Effects of shading levels on the composition and co-occurrence patterns of bacterioplankton and epibiotic bacterial communities of Cabomba caroliniana, 2021, WR.  原句：Chlorophyll a (Chl a) was measured spectrophotometrically using a 0.45-μm filter with ethanol as the extraction solvent:采用0.45 μm滤镜，乙醇为提取溶剂，分光光度法测定叶绿素a (Chl a)。