杨树愈伤遗传转化

参考文献

Wen SS, Ge XL, Wang R, Yang HF, Bai YE, Guo YH, Zhang J, Lu MZ, Zhao ST, Wang LQ. An Efficient Agrobacterium-Mediated Transformation Method for Hybrid Poplar 84K (Populus alba × P. glandulosa) Using Calli as Explants. Int J Mol Sci. 2022 Feb 17;23(4):2216. doi: 10.3390/ijms23042216. PMID: 35216331; PMCID: PMC8879841.

一、主要步骤：

        1、愈伤诱导

        2、共培养

        3、筛选抗性芽（芽诱导）

        4、生根筛选

二、主要两种方法：

        1、愈伤诱导和侵染同时进行；

        2、先愈伤诱导14-20天，再剥离愈伤进行侵染。

三、主要培养基

        1、愈伤诱导（CIM）：WPM+0.1mg/L KT+1mg/L 2,4-D

        2、共培养（CM）：WPM+20g/L Sucrose+0.5g/L MES+100uM AS

        3、筛选抗性芽（SIM）：WPM+0.05mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA

        4、生根筛选（RM）：1/2 MS+30 g/L sucrose+5 g/L agar+0.05 mg/L IBA + 0.02 mg NAA 

四、抗性浓度：Hyg 1-1.5mg/L, timentin 200mg/L

五、菌液浓度：OD600=0.4-0.6

六、侵染液制备方法

1、离心收集菌体，用重悬液重悬得到侵染液；

2、直接在菌液中加AS获得侵染液。

七、文章具体步骤（先愈伤诱导14-20天，再剥离愈伤进行侵染）

七、其他改良方法

（一）卢孟柱（愈伤诱导和侵染同时进行）

         1、摇菌的OD600为0.6，离心后用重悬液重悬得到OD600=0.3的侵染液；

        2、将叶片划出伤口后置于侵染液中15min；

        3、将侵染叶片用滤纸吸干菌液后，倒置铺在共培养培养基上，暗培养1～3天；

        4、在低浓度筛选培养基中暗培养到愈伤组织长出；

        5、在高浓度筛选培养基中暗培养愈伤组织生长至0.5～1.0cm（两周继代一 次）；

        6、转移至含有载体抗性对应的抗生素的分化培养基上；

        7、待不定芽生长至1-2cm后，切下转移至含有载体抗性对应的抗生素组合的生根培养基上。

每升用量	重悬液	共培养基	筛选培养基	分化培养基	生根培养基
基础培养基	WPM	WPM	WPM	WPM	MS2.215g
MES	0.5g	0.5g	0.5g	0.5g	-
蔗糖	20g	20g	20g	20g	10g
琼脂/植物凝胶	-	琼脂7.8g	凝胶5g	琼脂7.8g	琼脂7.8g
2,4-D	1.0mg/L	1.0mg/L	1.0mg/L	-	-
KT	0.1mg/L	0.1mg/L	0.1mg/L	-	-
葡萄糖酸钙	0.65g	0.65g	0.65g	0.65g	-
肌醇	0.1g	0.1g	0.1g	0.1g	-
6-BA	-	-	-	0.5mg/L	-
NAA	-	-	-	0.04mg/L	-
TDZ	-	-	-	0.02mg/L	-
IBA	-	-	-		-
头孢霉素	-	-	200mg/L	200mg/L	200mg/L
特美汀	-	-	300mg/L	300mg/L	300mg/L
潮霉素B	-	-	1.5mg/L-2mg/L	1.0mg/L-1.5mg/L	1.5mg/L
AS	-	100uM	-	-	-
pH	5.6	5.9-6.0	5.9-6.0	5.9-6.0	5.9-6.0

 （二）中科院（愈伤诱导和侵染同时进行）

       1、摇菌的OD600为0.4-0.6，离心后用重悬液重悬得到OD600=0.3的侵染液；

        2、将叶片划出伤口后置于侵染液中15min；

        3、将侵染叶片用滤纸吸干菌液后，倒置铺在共培养培养基上，暗培养2天；

        4、在低浓度筛选培养基中暗培养到愈伤组织长出；

        5、在高浓度筛选培养基中暗培养愈伤组织生长至0.5～1.0cm（两周继代一 次）；

        6、转移至含有载体抗性对应的抗生素的分化培养基上；

        7、待不定芽生长至1-2cm后，切下转移至含有载体抗性对应的抗生素组合的生根培养基上。

每升用量	重悬液	共培养基（WPMC）	筛选培养基（WPMS）	分化培养基（WPMD）	生根培养基（MS0）
基础培养基	WPM	WPM	WPM	WPM	MS 2.3g
MES	0.5g	0.5g	0.5g	0.5g	0.5g
蔗糖	20g	20g	20g	20g	10g
琼脂/植物凝胶		凝胶5g	凝胶5g	凝胶5g	琼脂7g
2,4-D	1.0mg/L	-	1.0mg/L
KT	0.1mg/L	-	0.1mg/L
6-BA	-	-		0.5mg/L
NAA	-	-		0.05mg/L
头孢霉素		-	200mg/L	200mg/L	200mg/L
特美汀		-	200mg/L	200mg/L	200mg/L
潮霉素B		-	1.0mg/L 2.0mg/L	1.5mg/L	1.5mg/L
AS		100uM
pH	5.6	5.9-6.0	5.9-6.0	5.9-6.0	5.9-6.0

（三）自己实验室（ 先愈伤诱导14-20天，再剥离愈伤进行侵染）

        1、愈伤生长

        （1）去掉叶柄，叶柄可以留下生长愈伤，并在叶片主脉上横向划出2-3道伤口正面朝下平铺在愈伤培养基（WPMY）上，25℃暗培养；

        （2）叶片生长二三十天后，将愈伤分成黄豆粒大小（小块的可以拼凑成大块）放入新的愈伤培养基（WPMY）继续生长；

        （3）使用时提前放入共培养基（WPMC）中。

        2、摇OD600为0.5

        3、侵染与共培养

        （1）3500rpm离心10 min ，倒掉上清液，加入等体积的重悬液，轻轻晃动使菌体重悬，于25℃，50转/分钟振荡培养1-2h。

        （2）浸染15 min后，待愈伤表面菌液吹干后，放置在共培养基（WPMC）上，在25℃下暗培养共培养60-70h

        4、筛选培养

        （1）在超净台上，将暗处理后的叶片转入特美汀浓度分别为100mg/L、0mg/L的洗菌液中，从高到低分别冲洗5min，然后放置于灭完菌的滤纸上吹干；

        （2）再转移到有筛选压（真核抗性）和脱菌（特美汀终浓度为200mg/L）分化培养基（WPMS）上，进行筛选培养，光照周期（光照16h/黑暗8h），温度25℃。

        （3）在不定芽长到半公分左右后，使用无菌的镊子或者手术刀切下有不定芽（注意观察不定芽的生长点，避免选同一细胞分化的不定芽），放到芽伸长培养基中。

        5、生根筛选

        不定芽长到1-2厘米时，使用无菌的镊子或者手术刀将不定芽单个切下，并放入生根培养基（1/2MS0）上进行生根培养。

八、总结

（一）共同之处

        1、愈伤诱导的培养基都是：WPM+0.1mg/L KT+1mg/L 2,4-D；

        2、共培养的培养基都是：WPM+20g/L Sucrose+0.5g/L MES+100uM AS。

（二）不同之处

        1、卢孟柱课题组的基础培养基加了肌醇和葡萄糖酸钙。其中共培养基和分化培养基没有用凝胶，但是凝胶会影响出芽率，所以建议都改成凝胶；

        2、中科院分化培养基没有TDZ，但TDZ是有利于出芽的，所以推荐有TDZ的配方。