编译：微科盟阿Z，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
最近已证明宿主遗传学是植物微生物组组成的驱动因素之一。然而，确定控制微生物选择的潜在遗传位点仍然具有挑战性。全基因组关联研究（GWAS）代表了一种潜在强力的、无偏的方法，可以鉴定对宿主基因型敏感的微生物，并将它们与影响其定植的基因位点联系起来。本文对200个高粱基因型的根际进行了群体水平的微生物组分析。使用16S rRNA扩增子测序，我们确定了与植物基因型具有遗传关联的根际相关细菌，并鉴定了这些谱系与最近在玉米中发现的可遗传分类群之间的显著重叠。此外，我们证明了GWAS可以识别与根际微生物组特定亚群丰度相关的宿主基因位点。最后，我们证明了这些结果可以仅基于宿主基因型信息来预测一组独立的高粱基因型的根际微生物组结构。
论文ID
原名：Genome wide association study reveals plant loci controlling heritability of the rhizosphere microbiome
译名：全基因组关联研究揭示了控制根际微生物组遗传力的植物基因位点
期刊：The ISME Journal
IF：10.302
发表时间：2021.5.12
通讯作者：Devin Coleman-Derr
通讯作者单位：美国加利福尼亚大学，植物与微生物学系
实验设计
从高粱协会（SAP）中随机抽取了200个基因型的亚型10000次，并使用R包“PopGenome”计算每个子集的核苷酸多样性总分。从这些数据中，选择具有最大多样性值的200个品系亚型（图1a，补充图1，补充表1）。对于用于确定GWAS适当样本类型的试点实验，选择了24个品系亚型，其中包括来自广泛系统发育距离的基因型（图1a，补充表1）。
图1. 样本类型和群体选择。A代表378名高粱协会（SAP，内环）成员的系统发育树，为GWAS选择的200个品系的子集（中心的第二个环，蓝色），用于样本类型选择的24个品系（Pilot，中心第三个环，黄色），以及用于GWAS验证的18种基因型，其中包含由GWAS（外环）鉴定的第4染色体次等位基因（红色）或主等位基因（棕色）。B来自16S rRNA扩增子数据集中涵盖试点实验中使用的所有24种基因型的叶（绿色）、根（黄色）和根际（红色）样本类型的Shannon熵值。C使用Bray-Curtis距离对叶（绿色）、根（黄色）和根际（红色）的24种基因型生成的主坐标分析。D针对所有24种基因型的每种样本类型绘制了Mantel’sR统计图，表明宿主基因型距离和微生物组距离之间的相关程度。
本研究中使用的试验田位于加利福尼亚州奥尔巴尼（37.8864 °N，122.2982°W），特征为粉质壤土，pH值为5.2。本研究中使用的美国SAP小组的种质来自GRIN（www.ars-grin.gov）。为了确保所有高粱幼苗的起始土壤微生物组均一并控制其种植密度，首先将种子播种到生长室中完全均匀的田间土壤混合物中，并控制环境因素（25 °C，16 h光周期），然后移植到现场。为了准备种子发芽的土壤，在距离田地0-20 cm深度处收集0.54立方米的种植土壤，随后用于种植，并通过在消毒水泥搅拌机中分别将四批相同大小的土壤与灌溉水混合，然后在消毒的防水布表面手动均化。然后将土壤转移到经过消毒的72孔植物托盘中。为了准备用于种植的种子，通过在10%漂白剂+0.1% Tween-20中浸泡10 min对种子进行表面消毒，然后在无菌水中洗涤四次。种植后的前3天，高粱幼苗每24 h用喷雾器喷水约5 mL，每三天浇一次水，直到第12天，然后移栽到田间。
田地由三个重复块组成，每个块包含200个小块土地，用于200个选定基因型中的每一个。将每种基因型的6株健康高粱苗移栽到各自的地块中，间隔15.2 cm，在移栽后两周进行间苗至每块地3株苗。使用1.89 L/h流量发射器进行滴灌，每周浇水3次，每次1 h。在整个生长季节每周进行3次人工除草。为确保基因型处于相似的发育阶段，并且宿主相关微生物组有足够的时间发育，在发芽后9周收集植物相关样本。只收获每个小块地块的中间植物，以帮助减轻由于与其他基因型相邻植物的根接触而导致的潜在的混杂植物-植物相互作用效应。
结果
1 多样化的高粱种质显示根际是基于微生物组的GWAS的理想选择
在这项研究中，通过一项涉及从SAP种质资源中选出的200种基因型的田间试验，探讨了宿主基因型与微生物组组成之间的关系（补充表1）。虽然最近在拟南芥中的一项研究成功地使用根微生物组（内圈）进行了GWAS分析，但它没有评估与根外（根际）密切相关的微生物。我们首先试图确定叶子、根内圈或根际样品是否最适合高粱中的下游GWAS。使用我们收集的200种基因型中的24种基因型亚型（图1a，补充表1），通过核糖体16S的V3-V4区域的双端测序分析了叶、根和根际样本类型的微生物组组成。由此产生的数据集表明，根和根际样本中的微生物多样性水平相对较高（图1b），地上和地下样本类型强聚类（图1c）。三个独立的Mantel’s测试（9999个排列）用于评估叶、根和根际样本类型的宿主基因型距离与微生物组组成之间的相关程度（图1d）；在三个区室中，只有根际表现出显著的Mantel’s相关性（R2 = 0.13，Df = 1，p=0.02）。基于这些结果，随后利用根际样品对200个品系进行了微生物组学研究，包括遗传力和GWAS分析。
为了研究高粱根际微生物组中宿主基因型依赖性变异，使用V3-V416S rRNA扩增子测序对600株田间种植植物（200种基因型各3个重复）的根际进行了分析。所得数据集包括代表29个细菌门的1189个OTUs。微生物组数据集的组成分析显示出与最近涉及来自各种田间地点的高粱根际微生物组研究一致的特征，其中变形菌、放线菌和酸杆菌构成前三个优势门（补充图3）。
2 高粱和玉米根际在可遗传分类群中表现出强烈的重叠
最近对两个单独的玉米微生物组数据集的研究表明，特定细菌系对宿主基因型的影响比其他细菌系更敏感。为了确定细菌谱系对宿主遗传学的反应是否是在不同植物宿主中保守的性状，我们评估了高粱数据集中单个OTUs的广义遗传力（H2）；H2量化了由遗传而不是环境影响解释的方差比例。更通俗地说，这种方法将细菌丰度视为一种不断变化的表型，类似于植物高度、生物量和产量。在我们的研究中，单个OTUs的H2范围从0%到66%（补充表4）。相比之下，在27个玉米自交系的两个实验中的第一个实验中，单个OTUs的H2最高为23%（在2010年进行），而第二个则最高为54%（在2015年进行）。此外，我们使用高粱多样性小组亲缘矩阵来计算基于SNP的狭义遗传力（h2）。与我们的预期一致，h2低于从表型数据估计的H2，可能是由于样条分析中空间分量的过度校正。尽管如此，h2与之前基于表型的估计值显著相关（R = 0.34，p = 2.2e-16）（补充图4a），特别是对于前100个可遗传的OTUs（R = 0.5，p = 1e-7，补充图4b)。
为了探索高粱数据集中具有高遗传力的微生物是否具有系统发育聚类性，我们使用0.15的H2截止分数将1189个OTUs划分为高度可遗传（n = 347）和低可遗传部分（n = 842）（图2a，补充表5）。与低遗传性OTU部分相比，观察到包括疣微菌目、黄杆菌目和浮霉菌门在内的几种细菌具有显著更多数量的高可遗传的OTUs（Fisher’s精确检验，q <0.05，图2a，补充表5）。值得注意的是，所有6种黄杆菌OTU仅存在于高度遗传的部分中（图2b）；相比之下，仅在低遗传部分中观察到40个其他细菌目。在确定某些细菌谱系具有较高比例的高度可遗传的OTUs后，我们旨在确定这些可遗传的OTUs所代表的总读取计数丰度的比例。一般来说，我们观察到每个分类群的读取计数丰度与遗传力相关，但也有一些例外（图2b）。例如，Bacillalles在高可遗传的部分中包含的OTUs数量少于低可遗传的部分，但可归因于其高度可遗传的OTUs的读数百分比是低可遗传部分中的读数的8倍，这表明其高度遗传的成员是根际内丰富的生物（图2b）。总的来说，这些数据意味着细菌谱系的特定子集对易受宿主基因型选择影响的成员进行了丰富。
图2. 高粱根际具有丰富的可遗传细菌。A属于所有OTUs（左柱）、低遗传OTUs（中柱）或高遗传OTUs（右柱）的前17个细菌目中每一个的OTUs的相对百分比。与低可遗传分数（H2 < 0.15）相比，在高度可遗传（H2 > 0.15）中具有显著不同的OTUs数量，由Fisher’s精确检验（q < 0.05）确定，用星号表示。B高遗传性和低遗传性OTUs计数（x轴）和读取计数丰度（y轴）之间的log2比率的顺序级散点图。圆圈大小代表每个细菌目的总读取计数丰度。仅存在于数据集的高遗传性（右上，黄杆菌目和5个“其他”合并目）或低遗传性（左下，40个“其他”合并目）部分的细菌分类群显示在虚线内，因为它们的log2遗传率是未定义的数字。
接下来，我们假设尽管玉米和高粱（在超过1100万年前发生分化的禾本科的两个成员）之间存在相当大的进化距离，但包含对玉米中宿主基因型效应最敏感的OTUs的细菌谱系也可能包含在高粱中表现出这种敏感性的OTUs。为了验证这一点，我们比较了来自玉米数据集（称为NAM2010和NAM2015）和上述高粱数据集的前100个最具遗传性的OTUs，产生了跨越65个细菌目的300个OTUs的组合数据集。去除高粱数据集（n = 18）中未观察到的细菌顺序后，我们注意到在至少两个数据集中观察到了一半以上，并且大约三分之一（n = 15）在所有三个数据集中都包含高度遗传的OTUs（图3a）。为了确定这种重叠是否明显大于偶然的预期，我们对10000组随机选择的高粱OTUs进行了置换重采样以进行比较。值得注意的是，我们发现与重采样的高粱OTUs相比，高可遗传的高粱部分与单个玉米可遗传部分和组合可遗传玉米OTUs之间的重叠是显著的（NAM 2010 n = 17，p =0.00909，NAM2015 n = 19，p =0.0016，合并的n = 15，p =0.0344）（图3a）。总的来说，这些结果意味着玉米和高粱中对基因型最敏感的细菌目之间存在保守性。
图3. 根际微生物的遗传力在玉米和高粱中是保守的。A本研究（高粱SAP）中鉴定的含有高度遗传OTUs的细菌序列的比例维恩图，与Walters等人发表的在两年不同时间生长的玉米嵌套关联映射（NAM）亲本系的大规模实地研究中报告的可遗传顺序进行比较。每个数据集的前100个可遗传OTUs（基于H2）按分类顺序进行分类生成维恩图。仅存在于SAP低遗传分数中的NAM高遗传顺序用蓝色部分表示。上标字母表示从总1189个高粱OTUs（10000个排列）中随机抽取100个高粱OTUs的频率与来自单一年份（a/b）或两者（c）的玉米OTUs产生更大的目水平重叠。B堆叠条形图显示在所有细菌目（x轴）的三个数据集中的任何一个中被确定为高度可遗传的OTUs的累积计数（y轴），每个目中至少有三个高度可遗传的OTUs。C每个目中高遗传性高粱OTUs相对于所有高粱OTUs的比例显示为热图。星号表示目中富含高度可遗传的OTUs（Fisher’s精确检验，q< 0.05）。
为了确定具有最大高遗传性倾向的细菌谱系，我们计算了上面确定的每个共享的高遗传细菌目中高遗传OTUs的数量。我们注意到，在所有三个数据集中包含最多高度可遗传OTUs的细菌目中，有几个代表了在根微生物组中经常观察到的大谱系；（例如，放线菌目）（图3b）。我们假设这一结果可能部分是由这些谱系在根际微生物组中的总体频率驱动的，更常见的谱系由于其无处不在而导致更高比例的高度可遗传的微生物。为了帮助解释这一点，我们通过属于每个目的高粱OTU总数（n = 1189）将高遗传性高粱OTUs的频率（n = 100）归一化（图3c，补充表6）。这些结果表明，虽然高度遗传微生物中放线菌目和黏球菌目的流行率与其在整个数据集中的普遍流行率一致，但伯克霍尔德菌目和其他两个谱系，包括疣微菌门和浮霉菌门，表现出在高可遗传的部分中显著的富集（Fisher’s精确检验，q <0.05 )，并预计不会仅受丰度的影响。
3 全基因组关联揭示了与根际微生物丰度相关的遗传位点
最近在叶微生物组方面的研究证明GWAS在揭示与微生物组组成相关的宿主基因位点方面具有潜在效用。在这里，我们试图使用OTU数据集的全局特性和单个OTUs的丰度将GWAS与根际微生物组数据集结合使用。对于整体群落组成，从1189个OTUs的丰度模式分析中选择了一个PCs的子集。为了优先考虑将单个PCs包含在我们的GWAS分析中，我们确定了前十个PCs中每一个的遗传力分数，这解释了我们数据集中总方差的75%（补充图5a）。H2等于或大于 0.25的PCs（PC1、PC3、PC5、PC9和PC10，补充图5a）服从于GWAS（补充图5b）。我们最初对GWAS应用了严格的基于Bonferroni的阈值（调整后的p值 < 0.05/21236）。然而，使用这种方法没有发现显著的SNPs，这表明该阈值过于严格并掩盖了潜在的真阳性关联，这是由于我们的数据中样本量小（n = 200）以及相对较低的遗传力（PC1的H2 = 0.35）。尽管通常将多个测试校正（包括Bonferroni校正）应用于GWAS来定义显著性截止值，但可以理解的是，这些截止值过于保守，因为假设测试的每个遗传变异都独立于其余的。为了发现Bonferroni校正遗漏的潜在真实关联，我们采用了一个反保守的错误发现率截止值-log10（p = 10-4）（Benjamini-Hochberg，q <0.22）来生成一个首选SNP列表。对PC1进行的GWAS分析解释了总方差的21%并具有第二高的遗传力（H2 = 0.35），这揭示了群落组成与4号染色体上的一个基因位点之间的相关性（n = 6）（图4a，补充图6a）。
图4. 高粱遗传位点与根际微生物丰度相关。APC1社区分析GWAS的曼哈顿图。超过-log10（p= 10-4）阈值的最佳候选SNP被圈出。B在PC1 GWAS识别的相同4号染色体基因位点上（下热图）的1.15 Mb窗口中，所有OTUs的单个OTU GWAS具有至少5个高于-log10（p= 10-2.5）阈值的SNPs。对于每个OTU，确定了该基因座内高粱主要（红色）或次要（蓝色）等位基因组之间丰度的log2倍数变化（上部热图）。OTU根据预测的每个细菌顺序中存在一个或两个膜（单胚层或双胚层）进行分组，并如图2所示着色。C4号染色体基因位点内高粱基因的组织特异性基因表达数据。深蓝色表示更高的表达（标准化FPKM）。星号表示预测其表达为根特异性的基因。
4号染色体基因位点上候选SNPs的MAF范围为0.021至0.036。我们在最显著的SNP（主SNP）和该区域周围的SNPs之间进行了LD分析。结果显示，主要SNP表现出与高LD的SNPs在物理上接近（< 1.6 Mb）并显示出相对较高的关联信号（补充图6b）。由于SNP插补利用了局域性LD信息，LD中的一组SNPs可能是由SNP插补引起的。然而，次要等位基因的SNP插补往往较差，因为与普通等位基因相比，可用于插补的数据较少。因此，在第4号染色体基因位点上存在多个表现出不同等位基因频率的GWAS信号表明，主要的SNP不太可能是统计伪影。使用染色体4位点SNP数据，我们将高粱基因型分为两个等位基因组，主要等位基因包含343个高粱基因型，次要等位基因包含14个基因型，在我们的200系GWAS亚群中存在六个包含次要等位基因的品系。使用这六个包含次要等位基因的基因型和每个次要等位基因基因型的密切相关的主要等位基因基因型，我们对受等位基因组的限制的根际微生物组进行了CAP排序。这将属于主要和次要等位基因组的基因型的根际分成不同的簇（补充图6c）。
随后的GWAS分析使用其他可遗传的PCs，PC3、PC5、PC9和PC10作为输入信号（补充图7）。对于这些PCs，我们没有观察到任何低于q <0.22阈值的SNPs。这种低信号可能部分是因为微生物群落的遗传力相对较低，性状是高度多基因的，并且基因组扫描涉及大量统计检验。然而，在PC5（p值 < 7 × 10-4）和PC10（p值 < 1 × 10-4）的6号染色体上有一个可识别的峰（补充图5b）。由于PC来自数据集中单个OTUs丰度的线性组合，因此尚不清楚在4号和6号染色体上观察到的相关性是由一组常见的还是由两组不同的微生物谱系驱动的。为了解决这个问题，我们使用数据集中每个单个OTU的丰度作为输入进行了单独的GWAS分析（图4b，补充图5c）。从这些分析中，我们确定了两组不同的39和10个OTUs，分别与染色体4和6上的基因位点显著相关，并且只有一个属于伯克霍尔德氏菌目的OTU在两个基因位点之间共享（补充图5c）。这意味着不同的高粱基因位点与不同微生物群的丰度模式相关。
为了了解4号染色体上已识别峰（图4a）与在该基因位点具有相似GWAS相关性的细菌分类群（图4b）之间的关系，我们首先试图了解这40个OTUs的相对丰度在整个高粱群体中的变化情况。我们观察到，在包含主等位基因的高粱基因型中更普遍的大多数OTUs属于单胚层谱系，而在次要等位基因组中更普遍的大多数OTUs属于双胚层谱系（图4b），表明在这个位点的宿主遗传机制与基础细菌性状相互作用。
为了探索哪些宿主遗传机制可能驱动在4号染色体上观察到的相关性，我们检测了从phytozomev12.1获得的公开可用的RNA-Seq数据集中的组织特异性表达模式，用于1.15 Mb间隔中的所有27个基因（图4c，补充表7）。在这些候选基因中，我们观察到了间隔特异性表达模式，包括几个表现出强根特异性活性的注释候选基因：γ碳酸酐酶样2（gamma carbonic anhydrase-like2）、假定性β-1,4木聚糖内切酶（a putativebeta-1,4 endoxylanase）和抗病蛋白RGA2（disease resistanceprotein RGA2）（图4c）。
4 高粱基因型数据可以预测微生物组组成
为了验证4号染色体上候选基因位点的等位基因变异导致根际组成差异，我们对另外18个高粱品系进行了后续生长室实验，包括原始研究中不存在的基因型。为了帮助从基因位点特异性效应中解开系统发育相关性，我们选择了跨越多样性小组的高粱基因型；此外，对于每个次要等位基因基因型（n = 9），我们还囊括了一个系统发育相关的主等位基因系（n = 9）（图1a）。在生长室中煅烧粘土和田间土壤的混合物中生长两周后，我们收集了每个基因型的根际微生物组，并使用16SrRNA扩增子测序分析了微生物组组成，如主研究所述。我们使用包含亲缘关系矩阵作为随机效应的混合线性模型进行了区域关联分析。通过严格的Bonferroni方法，我们检测到几个高于阈值的信号，这些信号在原始GWAS信号处于高LD位（补充图8）。限制于基因型组的CAP排序将属于主要和次要等位基因组的基因型的根际分成不同的簇（图5a，PERMAnova F = 2.66，Df = 1，p = 0.0061），基因型解释了数据集中大约7.5%（CAP1）的方差。
图5. 高粱遗传信息可用于预测不同生长条件下的根际微生物组组成。A在生长室中生长2周的九个主要等位基因基因型（红色）和九个次等位基因基因型（蓝色）的根际微生物组主坐标的典型相关分析。每个基因型使用两个重复，并通过线连接。B对于每个标志OTU，确定了高粱主要（红色）或次要（蓝色）等位基因组之间丰度的log2倍变化。OTUs根据每个细菌序列中一个或两个膜（单胚层或双胚层）的预测存在进行分组，并如图2和图4所示着色。
为了确定哪些分类群驱动了我们在CAP分析中观察到的聚类，并将其与我们主实验中对染色体4等位基因组作出反应的分类群进行比较，我们对验证数据集进行了指示物种分析。来自验证数据集（n = 65）中每个等位基因组的显著标志OTUs（q <0.05）的比较表明，与主实验中观察到的标志OTUs丰度相似（图4b），其中OTUs属于单胚层和双胚层谱系，分别在含有主等位基因的品系和含有次要等位基因的品系中富集。有趣的是，虽然大多数双胚层谱系在含有次要等位基因的品系中更为普遍，但包括芽单胞菌目、酸杆菌目和鞘脂杆菌目在内的几种双胚层谱系含有在主要等位基因系中更为丰富的OTUs。值得注意的是，在主实验期间的9周龄田间高粱的根际观察到了这种模式（图4b），在2周高粱生长室的验证实验中也观察到了（图5b）。总的来说，该实验支持我们主实验的发现，其中显示位于4号染色体上的基因位点的等位基因变异与特定细菌谱系的丰度相关。
讨论
1 植物根际微生物群落的宿主选择
以前的植物相关微生物组性状的GWAS经常用叶样本进行，最近的GWAS应用于根内生菌。然而，据我们所知，尚未尝试对根际进行GWAS分析。在这项研究中，我们比较了高粱叶、根和根际宿主基因型及细菌微生物组距离之间的总体相关性，并证明在这三者中，根际是进行实验以解开高粱微生物组遗传力的最有希望的部分。值得注意的是，高粱系统发育距离和微生物组距离之间的相关程度在根际最高，在叶子中最低。在根和根际观察到的这种更大的相关性可能部分是由于叶际的相对组成简单。即使是与土壤非常接近的拟南芥玫瑰叶，与根相比，也具有一个独特且相对简单的细菌群落。
相比之下，根际代表了土壤微生物组中高度多样化和稠密的子集，并可能提供更大的宿主可能对其施加影响的微生物库。或者，根际与微生物组组成的更大相关性可能是由于植物在其地上微生物组中选择附生植物的能力相对较弱所致；虽然叶际定殖者的到来在很大程度上被认为是由风和降雨扩散驱动的，但已知根系分泌物可以控制周围土壤环境中特定成员的趋化性和其他定植活动。这为在与植物表面直接相互作用之前选择其微生物的宿主提供了额外的机制。一旦进入根部，微生物就会受到额外的选择压力，包括逃避宿主免疫系统，这将决定它们是否作为内生菌存在。虽然我们观察到最高相关的高粱系统发育距离和微生物组距离发生在根际，但其他植物宿主可能在根际以外的组织中表现出最大的选择性影响。未来通过GWAS或相关技术研究宿主对微生物组控制的努力将受益于在探索不同宿主组织遗传力的初步研究之后仔细选择样本类型。
2 可遗传的根际微生物在宿主间具有系统聚类性和相似性
在根际，我们证明微生物组成分在H2中不同，高遗传分类群与玉米中鉴定的高遗传谱系有很强的重叠，跨越15个不同的细菌目。特别是其中三个目，疣微菌目、伯克霍尔德氏菌目和浮霉菌目在我们数据集的高遗传部分中显著丰富。由于伯克霍尔德氏菌的成员可以与植物和动物宿主形成共生关系，并且一些成员定殖于宿主属或种的特定成员，因此这种强烈的关系需要在宿主之间进行额外的遗传区分是可行的。在伯克霍尔德氏菌属中，这可以通过它们相对较大的泛基因组来促进，以及由大型多复制子基因组和丰富的基因组岛驱动的多样性。
这些观察结果表明，评估细菌遗传力可能会确定与植物宿主存在密切或共生但以前未被发现的新谱系。例如，我们观察到几种在土壤中常见的具有高遗传力的谱系，但缺乏文献中植物微生物相互作用的先前证据，包括疣微菌目和浮霉菌目。有趣的是，这些谱系的高遗传性可能是由于最近发现的存在于浮霉菌门和疣微菌门中的共享细菌微区基因簇促进的，这赋予了降解某些植物多糖的能力。事实上，已知微生物组的组成部分是由多糖来源的变化驱动的，包括植物细胞壁成分和根系分泌物。对缺乏这种遗传簇的细菌突变体进行额外的实验可能有助于揭示其在塑造植物微生物相互作用中的作用。最后，我们注意到这些结果部分是通过比较来自具有不同实验设计和分析线路的两项独立研究生成的数据集而产生的；我们预计，未来使用常见的园艺方法实验可以改进我们在此方面的努力，以鉴定跨植物宿主谱系的共同可遗传分类群。
3 高粱基因位点负责控制根际生物群落
我们的GWAS将宿主基因位点和宿主微生物组内特定细菌的丰度以及整体根际群落结构相关联。我们的研究建立在先前将GWAS应用于拟南芥根微生物组研究的基础上，表明该技术的应用可以进一步扩展到谷类作物的根际。使用这种方法，我们在4号染色体上确定了一个与特定细菌谱系相关的基因位点。值得注意的是，我们在交叉验证实验中检测到了类似的关联，其中包括独立的基因型和不同的环境条件，尽管在本研究中对GWAS应用了适度的统计严格性，但为该基因位点是真正的阳性提供了强有力的支持。我们在4号染色体基因位点中观察到几个带注释的候选基因，它们表现出很强的根特异性活性，包括γ碳酸酐酶样2、假定性β-1,4木聚糖内切酶和抗病蛋白RGA2。然而，基于基因表达模式的因果基因推断有很大的局限性，因为不要求控制这种关联的基因只在根中表达。例如，植物叶际的结构或激素变化可能会推动对根系分泌物成分的前馈效应。虽然我们的交叉验证实验侧重于4号染色体上的单个基因位点，但植物能够使用多种策略影响其微生物组，并且预测其中许多性状是复杂的（即由多个或多个基因控制）。因此，值得注意的是，我们仅在PC1GWAS中就检测到了五个额外的候选位点。此外，在PC5和PC10群体分析GWAS中都确定了6号染色体上的候选基因位点。引人注目的是，该基因位点与来自PC1GWAS鉴定的4号染色体基因位点的一组不同的微生物相关，这表明高粱能够利用不同的机制来调节不同的微生物群。未来利用这些基因和其他候选基因中的遗传突变体进行的验证实验可用于帮助阐明调控根际微生物群的潜在遗传因素。
结论
尽管微生物组变化的潜在宿主遗传原因尚不清楚，但候选驱动的方法已将抗病性、营养状况、糖信号和植物年龄作为主要因素。将宿主遗传学和微生物组组成联系起来的非候选方法，例如GWAS，有可能发现可以添加到此列表中的新机制。在这里，我们证明GWAS可以基于宿主遗传信息预测根际微生物组结构，建立在先前观察到微生物组种间和种内变异的研究的基础上。总的来说，我们的研究增加了越来越多的证据，表明植物宿主基因组内的遗传变异调节其相关的微生物组。我们预计植物微生物组关联的GWAS将促进对微生物组组装的宿主分子机制的全面理解，并通过促进育种工作来提升有益微生物组和提高植物产量。
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