漂白粉消毒海水效果评估——基于微生物群落组成和功能视角
Assessing the efficacy of bleaching powder in disinfecting marine water: Insights from the rapid recovery of microbiomes
Article, Water Research, 2023-05-27, [IF 13.4]
DOI：10.1016/j.watres.2023.120136
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0043135423005729
第一作者：Yawen Tang (汤雅文)；Huajun Zhang (张化俊)
通讯作者：Huajun Zhang (张化俊)；Demin Zhang (张德民)
合作作者：Jiaojiao Yan (闫娇娇)；Nan Luo (罗楠)；Xuezhi Fu (符学志)；Xiaoyu Wu (吴晓屿)；Jialin Wu (吴家林)；Changjun Liu (刘长军)；Demin Zhang (张德民)
主要单位：
宁波大学农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室 (State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Ningbo University, Ningbo, 315211, China)
宁波大学东海战略研究院 (Marine Economic Research Center, Donghai Academy, Ningbo University, Ningbo, 315211, China)
宁波大学海洋学院(Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province, School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo, 315211, China)
宁波海微生态科技有限公司(Ningbo Haiwei Ecological Technology Co., Ltd., Ningbo, 315141, China)
象山渔业技术推广站 (Xiangshan Fisheries Technical Extension Center, Ningbo, 315700, China)
- 摘要 -
单次漂白粉消毒是海水养殖常见的消毒策略，用以防控养殖病害的发生。然而，有效氯的衰减和消毒抗性细菌（DRB）的存在或对消毒效果有较大影响。当前，海水养殖中漂白粉消毒效果如何仍未有深入研究。本研究于对虾养殖帆布池中利用生产中通用剂量的漂白粉（120 ppm）进行海水消毒，探究漂白粉消毒后原核微生物群落组成（PCCs）和功能演变特征。结果表明，漂白粉在施用0.5 h后，PCCs发生显著改变，但在16 h后PCCs开始恢复，并于72 h恢复到初始的76％；这种快速恢复主要是由芽孢杆菌属（Bacillus）的衰退和假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）的再生引起，二者都是著名的DRB类群。高丰度（Abundant）类群不但是PCCs快速恢复的主因，还为群落功能恢复提供更多的功能冗余。在PCCs恢复过程中，群落构建主要由随机过程主导。在检测到的消毒抗性基因（DRGs）中，与外排泵系统相关的DRGs在72 h被显著富集，且均与葡萄球菌（Staphylococcus）和芽孢杆菌有关。此外，在检测到的16个抗生素抗性基因（ARGs）中，15个ARGs的相对丰度与消毒前无显著变化，表明漂白粉消毒无法有效去除ARGs。综上，由于单次漂白粉消毒后PCCs的快速恢复以及DRB和病原菌的广泛存在，单次漂白粉消毒效果未达预期。因此，未来应开发二次消毒或新型消毒策略进行养殖水体的消毒。
图形摘要
- 引言 -
对虾养殖海水中因细菌、病毒等病原的广泛存在，常对对虾养殖构成严重威胁。为控制病原传播，预防疾病爆发，常采取有效的消毒措施控制源水水质。漂白粉是养殖实践中常用的消毒剂，它具有氧化能力强、成本低廉且使用方便的特点。虽然漂白粉在杀灭微生物方面表现出色，但对虾养殖中由病原微生物导致的疾病仍然是对虾养殖健康发展的重要威胁。因此，深入解析消毒对海水微生物群落的影响对于掌握漂白粉消毒效果，优化消毒策略至关重要。
当前，消毒剂消毒后微生物群落动态变化研究主要聚焦于淡水输送管网和污水处理厂。大量研究表明，消毒后，短时间内水体细菌生物量、丰富度以及多样性均显著降低，而在消毒剂衰减后水体中细菌群落可在短时间内快速恢复，进而降低消毒效率。水体细菌群落的恢复主要与消毒抗性细菌（DRB）有关，如变形菌门（Proteobacteria）和芽孢杆菌中包含多种DRB类群，其多次被发现与消毒后水体细菌群落快速恢复有关。然而，由于海水与淡水环境的巨大差异，海水消毒后微生物群落如何演变，是否也经历快速恢复过程仍待阐明。此外，在对虾养殖实践中，漂白粉消毒后3天，海水即可用于后续养殖，若在3天内微生物群落恢复，或对后续养殖造成显著影响。因此，本研究于对虾养殖帆布池中开展漂白粉消毒海水实验，在3天的消毒过程中，解析以下问题：（1）漂白粉消毒后PCCs的演替特征；（2）高丰度和稀有（Rare）类群在PCCs演替过程中的作用；（3）消毒后DRGs和ARGs的变化特征。通过阐明以上问题，可以有效评估漂白粉消毒海水效果，对后续优化养殖水体消毒策略具有重要意义。
- 结果 -
1. 消毒后有效氯及可培养细菌数量变化
Active chlorine concentration and abundance of culturable bacteria
漂白粉添加后，有效氯含量在8 h达到峰值，随后逐渐衰减，72 h时已基本消解（图1B）。漂白粉表现出对细菌显著的杀灭作用，8 h时杀菌率达到99.1%，直到16 h时细菌数量均被控制在极低水平（图1C）。随后，细菌数量快速恢复，并在72 h时数量恢复到消毒前水平。
图1 实验过程中有效氯含量及细菌数量变化。
(A) 帆布池实验系统; (B)有效氯含量; (C)可培养细菌数量变化。
2. 原核微生物群落组成及恢复特征
Prokaryotic community compositions and recovery patterns
消毒后，PCCs在0.5 h时显著改变，并于16 h后开始恢复，这一生消过程主要由γ-变形菌（Gammaproteobacteria）和芽孢杆菌主导（图2A）。γ-变形菌先被大量杀灭，16 h后开始逐渐恢复，至72 h时恢复到51.21%。芽孢杆菌变化趋势与γ-变形菌相反。属水平上，群落演替主要由假交替单胞菌属和芽孢杆菌属主导，且细菌相对丰度变化与有效氯含量显著相关。群落中的高丰度类群组成变化与总群落较为一致（图2A），表明高丰度类群变化主导总群落的恢复。此外，分析高丰度和稀有类群的转化关系（图2B），发现高丰度类群的变化与余氯有显著的线性关系，表明高丰度类群变化的随机性低于稀有类群。
消毒后0.5 h，DRB类群主要包含芽孢杆菌属、Vitellibacter、 Maritalea和弧菌属（Vibrio）；在72 h时，葡萄球菌（Staphylococcus）、假交替单胞菌和交替单胞菌（Alteromonas）是主要的DRB类群。消毒前，共注释到93个潜在病原菌的ASVs，占序列总数的12.95%；72 h后共有159个潜在病原菌的ASVs，占总序列数的22.14%。注释的潜在病原菌主要为葡萄球菌、假交替单胞菌、Cutibacterium、弧菌和链球菌（Streptococcus），多数为DRB类群（图2C）。值得注意的是，消毒后潜在病原菌葡萄球菌和假交替单胞菌相对丰度显著升高；弧菌也并未被完全去除，只是数量被控制在较低水平。
图2 消毒后原核微生物群落组成变化。
(A) 总群落、高丰度和稀有类群组成变化；(B) 高丰度与稀有类群间转化及与有效氯的关系；(C) 潜在病原菌的相对丰度变化特征。
3. 原核微生物群落结构恢复及构建机制
Prokaryotic community structure and recovery patterns
总群落和高丰度类群具有相似的群落结构演替特征，且72 h后群落结构与消毒前较为相似（图3A，B）。利用消毒前与消毒后各时间点Bray-Curtis相似性的平均差异来评估PCCs的恢复程度（图3C），发现总群落在16 h后开始恢复，在72 h时与初始群落的相似性达到76%（差异为24%），表明海水中PCCs在用于养殖前已有较高的恢复水平。高丰度物种群落在72 h时恢复到初始的77%。系统发育多样性在4 h后显著升高，在72 h恢复到初始状态（图3D）。以上结果表明，消毒后PCCs经历了一个快速的恢复过程，主要受到高丰度类群的驱动。消毒后群落构建过程主要由随机过程所主导（图4A），且稀有类群的随机性显著高于高丰度类群（图4B）。消毒后，群落恢复由随机过程主导，意味着后续或可通过外界调控，如添加益生菌，调控消毒后水体群落，构建养殖益生群落。
图3 消毒后原核微生物群落结构恢复特征。
(A) 总群落、高丰度和稀有类群结构变化；(B) 三个类群Bray-Curtis距离变化特征；(C) 三个类群消毒后恢复度；(D) 系统发育多样性指数变化。
图4 消毒后原核微生物群落构建机制。
(A) 总群落、高丰度和稀有群落的随机百分率；(B) 三个群落随机百分率与物种丰富度的关系。
4. 原核微生物群落功能潜力及相关基因变化特征
Prokaryotic community compositions and recovery patterns
消毒后，群落功能也表现出快速恢复的特征，并且同样由高丰度类群所主导（图5A），且群落恢复过程中的功能冗余主要由高丰度类群所提供（图5B）；该发现与传统观点认为稀有可为群落提供较多功能冗余不同，可能由于消毒是对微生物群落较为彻底的破坏，这与自然环境中受扰动造成的群落变化有较大不同。
消毒后72 h，共有15个DRGs的相对丰度与消毒前比有显著变化（图6A），其中7个DRGs属于外排泵系统，5个属于胞外多糖（EPS）分泌系统，前者在72 h时被显著富集，而后者相对丰度则显著降低，表明外排泵系统在细菌抗消毒过程发挥重要功能。共现网络分析发现，DRGs的存在主要与葡萄球菌、芽孢杆菌和假交替单胞菌有关，且与潜在病原菌葡萄球菌的关联程度更高。在鉴定到的16个ARGs中，有15个在72 h后相对丰度与消毒前无显著差异，表明漂白粉消毒无法有效去除海水中的ARGs。
图5 消毒后原核微生物群落功能潜力特征。
(A) 总群落、高丰度和稀有群落的功能变化特征；(B) 高丰度和稀有群落的功能冗余。
图6 DRGs差异分析及与细菌的关系。
(A) 消毒前与消毒72 h后DRGs的差异；(B) 消毒后DRGs的变化与主要细菌属（左）及潜在病原菌的关系（右）。
- 讨论 -
本研究揭示了漂白粉单次消毒后原核生物群落组成和功能在72 h内的快速恢复特征及机制，阐明了恢复过程中芽孢杆菌的“消”和γ-变形菌的“生”在群落恢复过程中的关键作用。由于有效氯的消解和DRB的存在，单一漂白粉消毒无法有效控制水体中的病原菌，如葡萄球菌和弧菌等。消毒后原核微生物群落的高度恢复表明单次漂白粉消毒效果或未达预期，未来亟待优化当前消毒措施或开发新的源水管控技术以保障养殖源水水质安全。此外，本研究发现群落恢复由随机过程主导，表明消毒后在合适时机添加益生菌或有助于构建养殖水体的益生群落。
参考文献
Yawen Tang, Huajun Zhang, Jiaojiao Yan, Nan Luo, Xuezhi Fu, Xiaoyu Wu, Jialin Wu, Changjun Liu, Demin Zhang. (2023). Assessing the efficacy of bleaching powder in disinfecting marine water: Insights from the rapid recovery of microbiomes. Water Research, 241: 120136
- 作者介绍 -
第一作者
宁波大学海洋学院
汤雅文
2020级硕士生
研究方向：养殖水体微生物群落调控技术。
通讯作者
宁波大学海洋学院
张化俊（共同第一作者）
副教授，博士生导师
2015年毕业于厦门大学，获博士学位。2019.06-2020.07于美国加州大学圣地亚哥分校Scripps海洋研究所进行访学交流。长期从事强烈环境扰动下海洋微生物生态系统的响应特征及机制研究。主持国家自然科学基金项目2项，浙江省自然金基2项，其余项目8项；在Water Research、Environmental Pollution、Environment Microbiology及Science of the Total Environment等刊物发表论文40余篇，Frontiers期刊Guest Associate Editor和Review Editor。
宁波大学海洋学院
张德民
教授，博士生导师
农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室“微生物与水域生态健康”团队负责人。中国生态学会微生物生态专委会顾问主任，中国水产微生物生态与资源学委会副主席。主持完成国家863项目1项，国家自然科学基2项，浙江省杰青项目1项。国际上率先应用微生物组学研究养殖环境—微生物群落—对虾健康三者之间的动态互作关系，系统揭示了微生物群落稳态在对虾养殖健康中的核心作用，提出基于微生态视角的对虾健康养殖新理念新路径。在Microbiome、Water Research、 npj Biofilms and Microbiome、Molecular Ecology、Aquaculture等微生物学、生态学和水产学权专业期刊发表论文90余篇，授权专利6项。
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