mBio | 山大杜宗军/穆大帅发现硫酸盐还原细菌通过生态位修饰作用驱动海洋沉积物中的微生物群落组装...

硫酸盐还原细菌通过生态位修饰作用驱动海洋沉积物中的微生物群落组装

Niche Modification by Sulfate-Reducing Bacteria Drives Microbial Community Assembly in Anoxic Marine Sediments

Research Article，2023-3-29，mBio， [IF 7.77]

DOI：https://doi.org/10.1128/mbio.03535-22

第一作者：梁其云

通讯作者：穆大帅、杜宗军

第一完成单位：山东大学海洋学院

合作单位：美国俄克拉荷马大学周集中教授团队

- 摘要 -

硫酸盐还原细菌（Sulfate-reducing bacteria，SRB）是海洋厌氧环境中有机质降解的重要功能类群。然而，鲜有报道关于该类群如何调控微生物群落的研究。本研究基于自上而下的群落设计理念，采用抑制硫酸盐还原细菌的方式来揭示了该类群在有机质降解过程中对微生物群落的贡献。基于五个不同孵育阶段的高重复（N=20）的微宇宙，我们发现抑制SRB之后会影响到微生物群落的诸多指标，比如群落的组成、结构、分子生态网络以及群落组装过程。同时也发现了SRB和其他优势的谱系类群之间存在着基于正频率依赖性选择的共存模式。其中，SRB和海洋滑动细菌类群之间的关联最为突出，它们共同参与了分子生态网络演替过程中的保守性模块和关键节点，以及在群落的同质化选择的生态过程中都体现出了较大贡献。基于海洋滑动细菌类群的钼酸盐耐受性实验，我们认识到是“抑制SRB”（而不是SRB抑制剂—钼酸盐）导致了海洋滑动细菌类群的相对丰度的降低。抑制SRB之后，微宇宙体系中最明显的一个变化是降低之后的pH不能恢复成原先的弱碱状态，而这种弱酸的微宇宙环境对大多数的海洋滑动细菌类群来说并不是最适合的生存条件。因此，我们通过向抑制SRB处理组的微宇宙中添加pH缓冲剂（HEPES）来维持体系的pH状态；进而发现，在这种状态下，之前受到抑制的细菌类群的相对丰度有所恢复。这些数据也进一步支持了SRB可以通过调整生态位（恢复微宇宙的弱碱状态）来体现其生态效益。

重要性：

我们的实验模型为研究SRB的生态效益增加一种新的思考维度，即可通过靶向性抑制的方式对功能类群的生态贡献路径进行揭示。

关键词：

硫酸盐还原细菌、生物相互作用、分子生态网络、微生物群落组装、有机质降解

- 背景 -

在厌氧的海洋沉积物中，有机大分子的微生物降解是一个包括水解、发酵和矿化等多个过程的复杂的种间互作过程。已有研究表明，硫酸盐还原作用能够促进海洋沉积物中近50%的有机质的氧化。硫酸盐还原类群是一个多谱系类群，既包括硫酸盐还原细菌（SRB），也包括硫酸盐还原古菌（SRA），使得一些研究者使用硫酸盐还原原核生物（SRP）或者硫酸盐还原微生物（SRM）来表示该类群。在海洋沉积物中，硫酸盐还原细菌（SRB）具有较高的丰富度和丰度，进一步表明了该类群可能在海洋沉积物的碳硫循环过程中发挥着重要作用。

在氧化还原电位低的厌氧环境中，SRB与其他厌氧菌竞争可利用的常见底物，这些底物是有机物矿化过程的产物。除了这种竞争作用，SRB可能通过代谢产物（如生物素）的外排促进其他营养缺陷型细菌类群的生长。SRB与厌氧甲烷氧化古细菌的代谢过程相耦合，表现出强烈的种间合作关系。SRB作为海洋沉积物中的优势类群，其丰度的动态变化可以影响周围的非生物或生物环境以及整个微生物群落。然而，我们需要更多的实验数据来揭示，当群落中的某种特定功能受到抑制后，将如何影响微生物群落的组装过程？

群落组装理论是认识理解自然群落结构的一般性和可行性的理论框架。目前，微生物群落的组装由两种互补的机制所控制，其一是基于生态位理论的确定性过程，其二是基于中性理论的随机过程。宁大亮等研究人员基于Vellend提出的概念性群落组装过程框架开发了可以量化不同过程相对重要性的分析工具。同时，有许多工作基于微宇宙模型开展了对各种生态开放环境和封闭实验体系的群落组装的研究。优势类群可以对其环境产生足够大的影响，在群落演替过程中有助于招募新类群。因此，在群落组装过程中，优势类群与确定性过程之间存在着密切的关系。对于优势的功能类群SRB，本研究假设，在有机质厌氧矿化过程中，SRB可以通过生态位修饰过程来影响局部的环境从而体现其生态效益。

钼酸盐是硫酸盐的二价氧阴离子类似物，抑制硫酸盐转运和活化，从而抑制硫酸盐还原过程。因此，钼酸盐经常被用作SRB的特异性抑制剂。在本研究的微宇宙实验模型中，通过添加钼酸盐来进一步解释SRB在微生物群落中的作用，同时，设置了高度重复的平行数量（N=20）以减少变异值。基于本研究的实验模型设计，我们拟解决海洋沉积物中有机质厌氧降解过程中的两个问题：其一，SRB如何在微生物群落网络中发挥关键作用的；其二，SRB如何促进微生物群落组装的。

- 结果 -

钼酸盐阻断了有机质的矿化过程

在对照组中，硫酸盐浓度从第5天到第12天急剧下降；而在SRB抑制组，硫酸盐浓度则从第5天至第30天的仅呈现轻微变化（图1A）。同时，第12天至第30天的硫酸盐浓度变化在对照组和SRB抑制组中呈现出显著差异性，表明后者的硫酸盐还原被完全阻断。总可溶性Fe、总有机碳（TOC）、总无机碳（TIC）和pH的变化在对照组和SRB抑制组之间也显示出显著差异性。相反，亚硫酸盐和总磷含量没有呈现出显著差异。而总无机碳（TIC）在对照组和SRB抑制组的第12天至第30天之间的含量变化呈现出显著差异性。在孵育期间，挥发性脂肪酸（VFAs）在对照组和SRB抑制组之间呈现出显著差异性（图1B）。在SRB抑制组中，乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的浓度保持恒定并没有急剧降低，这与Sørensen等人观察到的VFAs的积累现象相一致，表明了VFAs的氧化受到抑制。

抑制SRB改变了细菌群落的组成和结构

基于180份16S rRNA基因的高通量测序数据，发现在对照组和SRB抑制组中，α-多样性从孵育的第0天到第5天显著下降，而在其他孵育时期则基本保持稳定（图2A-C）。对照组和SRB抑制组中的细菌群落多样性指数（Shannon-Wiener指数和InvSimpson指数）在第5天到第30天间呈现出显著差异性（图2C和图S1C）。SRB抑制组中的群落均匀度在第5天和第12天明显低于对照组，而在第21天至第30天则无显著性差异（图S1F和G）。在对照组和SRB抑制组中，细菌群落结构呈现出显著差异性（图2D和S1H；表1和S1）。同时，我们使用了一个简易指标来量化以前未检测到的OTU所代表的比例：在对照组中，发现检测到的新OTU的比例在第5天至第12天保持在8%，然后从第21天至第30天减少到约2；而在SRB抑制组中，这个比例从第5天到第30天保持在约4%（图S1I）。

为了解群落结构的变化在多大程度上是由于OTU的增加或者减少所致，我们采用了对β-多样性拆分的分析方法。在对照组中，物种更替对β-多样性的贡献大于嵌套性（物种损失）（图2E）。在SRB抑制组中，嵌套性（物种损失）对β-多样性的贡献大于物种更替（图2F）。

在对照组和SRB抑制组中，优势类群的谱系组成具有显著差异性（图S1J和K）。具体而言，Marinifilaceae、Desulfovibrionaceae和Desulfobacteraceae仅在对照组中是优势类群，而Acidaminococcaceae仅在SRB抑制组中是优势类群（图S2A）。基于线性判别分析（LEfSe）的结果，我们在对照组中发现Marinilabiliales（Marinifilaceae、Marinilabiliaceae和prolixiobacaceae）和一些SRB类群（Desulfovibrionaceae和Desulfobacteraceae）呈现出显著差异性，暗示它们之间存在密切的联系。

抑制SRB改变了网络特征

从对照组和SRB抑制组所构建的分子生态网络（MENs）与随机网络的比较来看，两者之间呈现明显的不同，所有的分子生态网络皆表现出无尺度和小世界的网络特征（表S2A）。在对照组中，参与网络构建的OTU的比例要高于SRB抑制组中参与网络构建的OTU比例。基于17种不同的网络特征（S2A），对照组和SRB抑制组中的MENs呈现出不同演替轨迹（图S3A和B）。在对照组和SRB抑制组中，所有MENs都是高度模块化的（表S2A）；同时，MENs中网络模块化的组织原则也在发生变化。在对照组中，总共有27个大模块（≥5个节点的模块），占MENs节点总数的75%至88%；而在SRB抑制组中，共有26个大模块，占节点总数的70%至85%。基于网络节点和中心节点的随机删除模拟，发现抑制SRB后可以显著降低MENs的鲁棒性，同时在孵育的第5、12和30天增加了网络的脆弱性。部分网络稳定性指标与网络复杂性之间存在显著的相关性（图S4D）。

抑制SRB之后是否会影响其他网络中成员的重要性以及网络的组织原则？对于这个问题，我们尝试从两个方面进行回答。首先，抑制SRB后改变了MENs中关键节点（keystone nodes：network hubs、module hubs和connectors）的谱系组成（表S2B）。在SRB抑制组中，有更多的关键节点（59：54）；同时，相同的关键节点仅占对照组和SRB抑制组关键节点的15.3%（表S2B）。其次，保守性模块在对照组和SRB抑制组中的演替不同。在对照组和SRB抑制组之间，仅有四个保守性的模块对，表明抑制SRB后明显改变了MENs中模块的同一性（图3）。

抑制SRB影响了不同生态过程的相对重要性

基于系统发育的空白模型（iCAMP）来量化不同群落组装机制的相对重要性，我们发现在本研究的实验模型中，均匀化选择（HoS）和扩散限制（DL）是群落组装中的主要生态过程，其相对重要性约占90%（图4A和B）。在SRB抑制组中，从第5天到第12天，HoS的相对重要性急剧下降，而DL急剧上升（图4C和D），表明SRB抑制组中的群落组装更倾向随机过程（图4E和F）。为了量化每个系统发育谱系中不同生态过程的相对重要性，将观察到的3337个OTU被分为134个单独的谱系（图5）。其中，HoS和DL主导了17个主要的谱系（>5%的相对丰度）（图5），表明只有少数谱系对生态过程有显著贡献。具体而言，抑制SRB后降低了Bin14（Desulfobacteraceae）、Bin20（Marinifilaceae）和Bin50（Vibrionaceae）对HoS的贡献，而Bin27（Bacteroidaceae）、Bin41（Fusobacteriaceae）和Bin85（Acidaminococcaceae）通过在抑制SRB后增加对DL的贡献，从而增强随机过程（图5）。

SRB通过生态位修饰促进了物种的共现

由于缺乏硫酸腺苷转移酶（Sat）和类YcaO结构域的编码基因，对照组中的多数优势类群不太可能对钼酸盐敏感，但是通过抑制SRB后，部分优势类群的相对丰度也受到了抑制。在这些相关的优势类群中，我们这样的三个特点重点关注了海洋滑动细菌类群与SRB之间的密切关联：其一，6个SRB成员和7个Marinilabiliales成员共同作为对照组中MENs的关键节点（表S2B）；其二，Marinilabiliales成员在对照组的保守性模块中的贡献与SRB相类似；其三，一些Marinilabiliales成员在对照组的同质化选择的相对重要性与SRB相类似。为进一步理解为什么在SRB抑制组中Marinilabiliales类群也会被抑制。首先，我们先核实了Marinilabiliales类群自身对钼酸盐的耐受性。基于分离菌株的钼酸盐耐受性实验，表明Marinilabiliales类群具有较强的钼酸盐耐受性（图6A）。这些结果表明，抑制SRB本身（而非SRB的抑制剂—钼酸盐）可能是导致Marinilabiliales相对丰度的下降主要原因。

值得注意的是，在对照组从第5天到第12天的孵育过程中，微宇宙中的pH从弱酸性转变为弱碱性（图1A），这一状态接近Marinilabiliales成员的最适pH（图6B；表S3C）；而在SRB抑制组从第5天到第12天的孵育过程中，微宇宙中的pH始终保持弱酸性（图1A），这一状态接近Marinilabiliales成员的最小pH（图6B；表S3C），同时不适合大多数Marinilabiliales成员（32/59）的生长。因此，我们假设在微宇宙中稳定的弱碱状态可以维持Marinilabiliales的相对丰度。为了验证这一假设，我们将pH缓冲液添加到SRB抑制组的微宇宙中。我们发现这些微宇宙中的pH由弱酸状态恢复成了对照组中的弱碱状态（图S6A）。同时，在第5天至第12天的培养过程中，Marinilabiliales中Marinifilaceae的相对丰度有所增加（图S6B）。这些结果在一定程度上支持了微宇宙中稳定的弱碱状态可以促进SRB和Marinilabiliales的物种生存。

细菌中生物合成基因的丢失常常影响其在环境中的存活状态。我们评估了对照组和SRB抑制组中大部分优势类群的代谢物的生物合成能力，发现其中许多都是营养缺陷型（图6C和S6C）。SRB和Marinilabiliales在某些代谢产物（例如，l-脯氨酸，l-鸟氨酸，l-半胱氨酸和维生素B7和B12）的生物合成上存在互补性。因此，我们假设SRB可能通过提供代谢产物（如氨基酸和维生素）以交叉喂养来促进营养缺陷型的Marinilabiliales的生长与物种共存。为验证这一假设，我们随机选择了10个Marinilabiliales菌株（表S3B），发现这些菌株在具有各种代谢物（例如，L-脯氨酸，L-鸟氨酸，L-半胱氨酸和维生素B7和B12）的最小培养基上呈现吃过药显著的促生长效果（图S6D）。上述结果表明，SRB可以通过生态位修饰来改变生态位，进而促进物种共存，尤其是与Marinilabiliales的物种共存。

- 讨论 -

海洋沉积物中有机质的降解是一个复杂的物种间过程，包括水解、发酵和矿化。虽然SRB在有机质矿化过程中起着重要作用，但它们究竟是如何调控微生物群落仍不清楚。我们基于对照组和SRB抑制组之间的比较，系统地分析了SRB在微生物群落组成、结构，网络和生态过程中的贡献。

挥发性脂肪酸（VFAs）的快速积累表明，在孵化开始的5天内开始了有机物的初级发酵，这类似于在亚北极海洋沉积物中蛋白质和脂质大分子的降解。在这一阶段，所有微宇宙环境中的pH和TOC都有所下降，当硫酸盐含量并没有降低。在对照组的微宇宙中，孵育5天后，SRB的相对丰度有所增加且转变为优势类群。同时，VFAs的氧化在抑制SRB后被阻断。这些结果支持了水解过程和发酵过程是有机质生物降解的上游环节。SRB有助于VFAs的氧化，通过去除酸性VFAs将pH从弱酸性恢复成弱碱性，并产生代谢物（例如H2S），其作为强大的环境过滤器服务于确定性生态过程。我们的孵化环境（封闭系统）类似于环境压力，进入孵化阶段后降低了网络的稳定性，而SRB构建的强大的环境过滤器减缓了有机质降解过程中网络稳定性的下降（图S4A和B）。

尽管对照组中大多数的优势类群由于缺乏硫酸腺苷转移酶（Sat）和类YcaO结构域而可能对钼酸盐不敏感（图S5A），但它们的相对丰度仍在SRB抑制组中被抑制（图S2A）。这种间接抑制可能的原因有以下三种：其一，SRB可作为代谢物库（例如氨基酸和维生素），进而支持这些营养缺陷型生物的生长。其二，SRB具有调节pH和修复酸性环境的能力。pH值的变化（酸化）类似于“公害”，可以杀死或抑制自己或其他成员。如果没有SRB的调节，在孵育期间产生的酸性环境可以抑制许多细菌的生长。其三，由硫酸盐呼吸产生的硫化物可以调节微宇宙中的氧化还原电位，从而作为决定某些厌氧细菌生长的因素。因此，SRB可以对其非生物和生物环境产生足够大的影响，从而改变其生态位。然而，需要进一步的研究来揭示相互作用的机制。

我们的研究揭示了对照组的有机质降解过程中积极相互作用的丰富性，支持了积极相互作用可以促进其他物种参与“非零和博弈”的观点。而积极的相互作用似乎在支持微生物群落生物多样性和生产力方面发挥着重要作用。这些假设也得到了本研究的支持，其中抑制了SRB与其他类群之间的正相互作用，从而导致有机质降解过程受到抑制，进而降低了群落的α-多样性。许多机制可以解释SRB和本研究模型中其他细菌之间正相互作用的普遍性。其一，考虑到有机质降解的动力学，促进者可能分泌了有机质降解酶，增加了中间产物和提高了整体的碳利用率。其二，促进者可能外排了受益菌株可使用的不完全氧化的代谢物。这种“溢出代谢”可以使菌株受益。第三，促进者可能通过调节周围的微环境（例如，改变pH值）来修饰生态位，以促进受益菌株从休眠状态复苏。

总之，本研究为届时SRB如何贡献其生态效益提供了强有力的证据。我们的分析表明，SRB作为VFAs矿化过程中最活跃的类群之一，在微生物群落演替过程中，增强了分子生态网络的稳定性以及网络模块的保存性，维持了与Marinilabiliales的物种共存，并积极参与了群落组装中的同质化选择过程。

参考文献

Liang Q-Y, Zhang J-Y, Ning D, Yu W-X, Chen G-J, Tao X, Zhou J, Du Z-J, Mu D-S: Niche Modification by Sulfate-Reducing Bacteria Drives Microbial Community Assembly in Anoxic Marine Sediments. mBio 2023, 14:e03535-03522.

- 作者简介 -

第一作者

山东大学

梁其云

博士

山东大学海洋学院2019级生物与医药，工程博士

E-mail：qfsfdxlqy@163.com

Twitter：https://twitter.com/qyliang1

GitHub：https://github.com/2015qyliang

参加开源组织：https://github.com/openbiox

通讯作者

山东大学

杜宗军

教授

山东大学海洋学院教授、博士生导师、副院长、学术委员会主任委员

山东省海洋微生物菌种保藏与应用工程技术研究中心主任

威海市海洋微生物技术重点实验室主任

山东大学海洋生物工程技术研究中心主任

E-mail：duzongjun@sdu.edu.cn

研究工作：建立了山东省海洋微生物菌种保藏与应用工程技术研究中心，保藏微生物1.5万余株，平台提供菌种鉴定、共享、筛选等技术服务（http://sdum.wh.sdu.edu.cn）；致力于细菌分离培养技术以及分类学研究，在细菌分离培养方面形成了独特的技术体系。发现了大量具有重要研究价值的细菌新类群，例如海洋沉积物中细菌区系的核心成员——伍斯菌科。发表海洋细菌新纲1个（童第周菌纲），新目3个，新科5个，新属40余个。

山东大学

穆大帅

教授

山东大学海洋学院教授、博士生导师

E-mail：dashuai.mu@sdu.edu.cn

社会兼职：

山东微生物学会海洋微生物学专业委员会委员

山东微生物学会科普工作委员会委员

中国微生物学会会员

《Antonie van Leeuwenhoek》Associate Editor

《Frontiers in Marine Science》Editor Board Member

研究方向：

1、海洋微生物多样性及微生物组研究

2、海藻的微生物降解及生物能源转化研究；

获奖情况：

2021.01.19 第五届微生物技术国家重点实验室青年人才学术交流会“二等奖”

2020.10.23 中国微生物学会学术年会“优秀报告奖”（成都）

2019.10 山东大学“青年学者未来计划”

2018.10.21 中国微生物学会学术年会“优秀报告奖”（南昌）

2015.09 江苏省优秀博士论文

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