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黑米饮食通过调节色氨酸代谢和激活AHR通路缓解结直肠癌发展
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研究论文
● 原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.165
● 2024年1月15日，华中农业大学陈振夏、湖北省肿瘤医院魏少忠和梁新军等团队在iMeta在线联合发表了题为 “Black rice diet alleviates colorectal cancer development through modulating tryptophan metabolism and activating AHR pathway” 的文章。
● 本研究审查了富含膳食纤维和花青素的黑米饮食（BRD）的潜在抗肿瘤属性，结果表明BRD可能通过促进保护性肠道微生物组和代谢物谱来防止肠道肿瘤的发生；并且全谷物，特别是黑米主食具有巨大的潜在价值。
● 第一作者：王玲、涂懿璇、陈露
● 通讯作者：魏少忠（weishaozhong@163.com）、梁新军（doctorlxj@163.com）、陈振夏（mailto:zhenxia.chen@hzau.edu.cn）
● 合作作者：于可纯、王鸿恺、杨淑乔、张元、张帅杰、 宋硕、徐洪丽、尹竺晟、 丰明乾、岳君秋、黄祥宏、唐堂
● 主要单位：华中农业大学生命与健康学院、中国农业科学院深圳农业基因组研究所、湖北省肿瘤医院
亮 点
● 黑米饮食可以减缓ApcMin/+和AOM/DSS结直肠癌模型小鼠结肠肿瘤的发展；
● 黑米饮食增加了肠道益生菌的丰度，如单形拟杆菌和乳杆菌，同时减少了潜在的肠道病原体；
● 黑米饮食中上调代谢产物吲哚和吲哚-3-乳酸是芳烃受体通路的配体，通过激活肠道AHR受体基因表达，减缓结直肠癌的发展；
● 通过改善肠道菌群和代谢产物，适量食用黑米有望成为预防和治疗结直肠癌的潜在策略。
摘 要
膳食纤维和花青素的摄入与降低结直肠癌（CRC）发病率有关。本研究审查了富含膳食纤维和花青素的黑米饮食（BRD）的潜在抗肿瘤属性。我们的结果显示，与对照饮食组相比，BRD饲喂小鼠肠道肿瘤的大小和数量均显著减少，进而延长寿命。此外，将BRD喂养小鼠的粪便移植到无菌小鼠中可以保持肠道屏障的完整性并减少结肠细胞增殖。宏基因组结果表明，BRD小鼠肠道菌群组成发生显著变化，特别是益生菌Bacteroides uniformis和Lactobacillus丰度增加。此外，代谢组结果也显示，BRD小鼠肠道代谢物也出现显著变化，上调了吲哚-3-乳酸和吲哚的含量。这些代谢物可以激活肠道芳香烃受体通路，从而抑制CRC细胞增殖和结直肠肿瘤发展。总的来说，这些发现表明BRD可能通过促进保护性肠道微生物组和代谢物谱来防止肠道肿瘤的发生。结果还表明，全谷物，特别是黑米主食具有巨大的潜在价值。
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全文解读
引 言
结直肠癌（CRC）是一种常见的恶性肿瘤，对公共卫生和医疗系统造成了巨大的损失和负担。作为一种消化道癌症，CRC的风险与各种饮食有关，例如，全谷物的摄入就与较低的CRC风险相关。最近，一项荟萃分报告每增加10克/天的总膳食纤维摄入量可降低10%的CRC风险。从生物学角度来看，膳食纤维和全谷物对CRC风险的潜在保护作用是合理的。全谷食物是膳食纤维的主要来源，通过促进粪便的体积、稀释粪便中的有害物质以及减少传输时间，限制致癌物与结直肠黏膜之间的相互作用，从而可能减轻CRC的风险。此外，细菌发酵纤维产生的短链脂肪酸可能对CRC提供保护作用。在全谷物中还含有抗氧化剂、维生素、微量矿物质、植酸、酚酸、木质素和植物雌激素等，这些成分也可能有助于预防CRC。由于其高叶酸和镁含量，整个谷物的摄入与较低的CRC风险有关。
CRC与许多其他癌症不同，它在肿瘤发展过程中与数以万计的肠道微生物相互作用。与此同时，肠道微生物组的构成可能会促进或抑制CRC的发展，而微生物产生的代谢产物，如胆汁酸和短链脂肪酸，可能对CRC的发展产生重要影响。尽管全谷物摄入和平衡的肠道微生物组与CRC发展有拮抗作用，但全谷物摄入、肠道微生物组成及其代谢产物变化在CRC发展中的复杂关系尚不明确。
稻米是全球许多地区的主食。黑米作为一种稻米，保留了富含各种营养物质和生物活性化合物的麸皮层而与精糙米有所不同。多项研究表明，黑米麸皮层中的花青素色素表现出显著较高的抗氧化活性。此外，麸皮层还具有丰富的纤维含量。这种纤维能够结合胆汁酸和致癌物质，有助于恢复结肠的屏障。然而，目前对于将黑米用作饮食系统以探讨其对CRC发展的影响的研究尚不足。在这项研究中，我们使用了富含花青素的全谷物饮食——黑米饮食（BRD），以两种CRC小鼠模型为实验对象，研究了BRD在抑制CRC发展中的潜在作用。我们发现，BRD可以通过维持肠道微生物的稳态，富集益生菌并减少致病菌，延缓小鼠CRC的发展。这项研究对于推动癌症预防方法和促进健康产品（如功能性食品）的发展具有重要意义。
结 果
BRD可以显著延缓ApcMin/+和AOM/DSS小鼠中CRC进展
黑米饲料的科学定制是开展黑米健康效用研究的前提，例如满足成熟小鼠的营养需求，并保持营养物浓度和能量与对照饲料一致。因此，本研究选取了标准饲料配方 AIN-93M 作为对照组饮食（CD），这是一种由精制成分制成的广泛使用的纯化饮食，常用于饲喂成熟啮齿动物。在对照饲料中添加了 50%的黑米作为黑米饮食（BRD）。
为了研究黑米饮食对结直肠模型小鼠寿命的影响，本研究首先将结直肠癌模型ApcMin/+小鼠随机分为对照饮食组和黑米饮食组，从适应性喂养一周后开始给予不同的饮食处理，直到自然死亡（图1A）。结果显示，对于 ApcMin/+小鼠，对照组小鼠的最长存活时间为 221 天，相比之下黑米组小鼠延长了 15.4%（最长存活时间：255 天）。对照组的平均存活时间为 159 天，而黑米组延长了 20%（平均存活时间：190.8 天）（图 1B）。统计结果显示，BRD组的小鼠体重较CD组小鼠更低（图1C）。与食用CD的小鼠相比，食用BRD的小鼠结肠肿瘤数量更少，体积也较小，如图1D所示。对结肠样本的组织病理学分析表明，与CD组相比，食用BRD的小鼠腺癌、高级别异型增生和低级别异型增生的发生率降低（图1E）。食用BRD的动物结肠切片显示Ki-67阳性细胞数较少，表明细胞增殖减少（图1F）。与此同时，BRD组小鼠中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达降低（图1G），再次表明BRD组小鼠中细胞增殖减少。上述发现表明BRD能够缓解ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的发展。
肠道屏障是机体的一种保护机制，防止有害物质进入血流，从而避免病理生理变化的连锁反应。为了研究黑米在延缓结肠癌发展中的作用机制，本研究评估了BRD对小鼠结肠通透性的影响。首先测量了血清中脂多糖（LPS）的浓度，与食用CD的小鼠相比，食用BRD饮食的小鼠血清中LPS含量较低（图1H）。肠屏障结构的透射电子显微镜分析证实，食用BRD的小鼠结肠细胞间连接相对正常。然而，食用CD的小鼠显示了结肠细胞间连接的异常，包括顶部连接复合物和细胞间隙的扩大（图1I）。杯状细胞是一种在肠道内创建粘液屏障的专门上皮细胞。使用Periodic Acid–Schiff染色，确定每个隐窝中杯状细胞的数量。结果显示，与食用CD的动物相比，食用BRD的小鼠的平均杯状细胞数量较多（图1J）。此外，维持肠道屏障完整性所必需的紧密连接蛋白，即ZO-1、Occludin和Claudin-3的水平在食用BRD的小鼠中升高（图1K–N）。结果表明，BRD不仅保护了肠道的机械屏障，还保护了其化学屏障。
考虑到增加的肠道通透性可能导致慢性炎症，我们进一步检查了CRC小鼠的炎症水平。酶联免疫吸附法（ELISA）结果表明，BRD下调了促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的表达，同时上调了抗炎细胞因子IL-4和IL-10（图1O-R）。这表明BRD降低了ApcMin/+小鼠的血清炎症水平。
为了证实这些发现，我们采用AOM/DSS处理的C57BL/6小鼠模型，以确定BRD的效应是否特定于特定的CRC小鼠模型。与ApcMin/+模型类似，食用BRD的AOM/DSS处理的小鼠表现出29.5%的平均生存时间延长，较低的体重，减少的肿瘤数量和体积，改善的肠道屏障功能以及减轻的炎症水平。这些一致的观察结果表明，BRD可能在多个小鼠模型中抑制结肠肿瘤的发展。
图1. 黑米饮食延缓 ApcMin/+小鼠 CRC 发展
（A） ApcMin/+模型小鼠饲喂模式图；（B）对照饮食（n=35）与黑米饮食（n=28）饲喂的 ApcMin/+模型小鼠生存曲线；（C）22 周黑米组和对照组小鼠体重；（D）22 周黑米组和对照组小鼠肠道代表性图片，肠道肿瘤数目和大小统计；（E）肠道 HE 染色代表性图片和量化；（F）Ki-67 免疫组化代表性图片和量化；（G）PCNA 蛋白图片和量化；（H）血清中 LPS 水平定量；（I）透射电镜代表性图片。（J）PAS 代表性图片以及量化；（K-N）肠道屏障蛋白 ZO-1、Claudin-3 和 Occludin 免疫组化代表性图片和量化；（O）血清中抗炎因子 IL-4 水平；（P）血清中抗炎因子 IL-10 水平；（Q）血清中促炎因子 IL-6 水平；（R）血清中促炎因子 TNF-α 水平。
肠道微生物介导黑米饮食（BRD）对结肠癌（CRC）发展的保护效应
肠道微生物依赖于膳食底物，通常作为食物对癌症促进或抑制效应的中介物。因此，我们假设不同的膳食条件可能会影响微生物群落变化，黑米饮食有可能促进有益微生物的富集。并且我们通过将BRD小鼠或CD小鼠的粪便转移给无菌小鼠，来验证我们的假设（图2A）。
为了验证假设，我们在无菌小鼠（GF-BRD，灌胃BRD小鼠的粪样）和（GF-CD，灌胃CD小鼠的粪样）之间进行了与上述BRD小鼠和CD小鼠比较相同的细胞增殖、肠道屏障功能和炎症水平的检测。就细胞增殖而言，我们发现与GF-CD小鼠相比，GF-BRD小鼠显示出更少的高级别和低级别异型增生（图2B）。GF-BRD小鼠的结肠组织中Ki-67阳性细胞减少（图2C）。与此一致，GF-BRD小鼠中的PCNA蛋白发生了降解（图2D）。在肠道屏障功能方面，结肠组织中杯状细胞数量减少（图2E），GF-BRD小鼠的血清中LPS水平降低（图2F）。透射电子显微镜证实了GF-BRD小鼠结肠细胞间连接相对正常，而GF-CD小鼠结肠细胞间连接异常，包括顶部连接复合物和细胞间隙的扩大（图2G）。此外，与GF-CD小鼠相比，GF-BRD小鼠的结肠组织中ZO-1、Claudin-3和Occludin的表达增加（图2H–K）。一致的是，ELISA结果显示GF-BRD小鼠中抗炎细胞因子IL-4和IL-10的表达上调（图2L，M），而促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达下调（图2N，O）。所有这些结果表明，肠道微生物和代谢产物在介导BRD对结肠肿瘤发展的保护效应中发挥了关键作用。
图2. 粪菌移植后无菌小鼠肠道肿瘤发展情况
（A）粪菌移植模式图；（B）H&E 染色用于小鼠结肠病理诊断；（C）对照和黑米饮食无菌小鼠结肠 Ki-67 免疫组化染色及 Ki-67 指数定量分析；（D）对照和黑米饮食无菌小鼠结肠组织中细胞增殖指示蛋白 PCNA 的表达水平；（E）PAS 染色结肠杯状细胞数量；（F）对照和黑米饮食无菌小鼠血清 LPS 浓度；（G）透射电子显微镜拍摄的细胞间连接的代表性图像；（H-J）免疫组化法测定对照和黑米饮食无菌小鼠结肠组织中粘附分子 ZO-1、Claudin-3 和 Occludin 的分布及定量。（L-M）对照和黑米饮食无菌小鼠血清抗炎 IL-4 和 IL-10 浓度，（N-O）对照和黑米饮食无菌小鼠血清促炎 TNF-α 和 IL-6浓度。
BRD改变了结肠癌小鼠模型的肠道微生物组成，增加了单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）的丰度
为了进一步找出可能被BRD上调的对抗结肠肿瘤发展的有益微生物群，我们对BRD和CD饲养的CRC小鼠，以及CD饲养的野生型（WT）小鼠，在癌前期和肿瘤期（两个CRC模型均适用）进行了宏基因组测序及比较分析。
在ApcMin/+模型中，尽管用于测量生态学中物种多样性的“Simpson Index”在各种饮食组之间没有差异（图3A），但在使用Bray–Curtis指标（用于比较样本或群落之间的相似性或差异性）时，可以检测到不同饮食组的微生物组成差异（图3B）。为了确定与每个饮食组相关的特定细菌变化，我们比较了BRD饲养的ApcMin/+小鼠和CD饲养的ApcMin/+小鼠，以及CD饲养的WT小鼠和CD饲养的ApcMin/+小鼠，在14周（代表癌前期）和22周（代表肿瘤期）的粪便样本中菌群变化。我们观察到，在BRD饲养的ApcMin/+小鼠和CD饲养的WT小鼠中，B. uniformis的丰度较CD饲养的ApcMin/+小鼠更高（图3C、D，S2，表S2）。共现性分析显示，B. uniformis与大肠杆菌等有害细菌呈负相关，与益生菌如约翰逊乳杆菌和罗伊特乳杆菌呈正相关，表明B. uniformis可能在减缓CRC发展中发挥有益作用（图3E）。
我们还比较了GF-BRD和GF-CD小鼠的宏基因组。PCA结果显示GF-BRD小鼠和GF-CD小鼠的微生物β多样性存在差异（S1：图S2A）。GF-BRD小鼠中B. uniformis的丰度较高（S1：图S2B和S2：表S3），支持B. uniformis在CRC发展中的有益作用。
在AOM/DSS CRC模型中，BRD组在癌前期（第一次DSS处理后）和肿瘤期（第三次DSS处理后）均表现出较高的Shannon和Simpson指数（S1；图S3A），代表较高的α多样性。Bray–Curtis距离分析揭示了BRD与CD之间的差异（S1；图S3B），表明BRD增强了肠道微生物的多样性并改变了它们的组成。与ApcMin/+模型类似，在肿瘤阶段，CD饲养的WT小鼠和BRD饲养的CRC小鼠中B. uniformis的丰度较CD饲养的CRC小鼠更高，而致病性大肠杆菌在CD饲养的WT小鼠和BRD饲养的小鼠中较少（S1：图S3C,D和S2：表S4）。此外，共现性分析表明B. uniformis与有益的L. johnsonii呈正相关，与有害的大肠杆菌呈负相关（S1；图S3E），再次表明B. uniformis在CRC发展中的有利作用。
为了探讨B. uniformis在人类CRC发展中是否也起到潜在作用，我们分析了六组已发表的宏基因组数据，以确定人类肠道细菌的丰度。在经过一致的处理过程后，我们的荟萃分析显示，在健康个体中，B. uniformis相对于CRC患者更为丰富（图3F），暗示了B. uniformis在CRC患者中的有利效应。此外，我们通过与两种不同的人类CRC细胞系SW620和HCT116的共培养实验研究了B. uniformis的影响。与与大肠杆菌或空白对照共培养的细胞相比，与B. uniformis共培养的细胞生长较慢（图3G），再次支持B. uniformis可能在人类中抑制CRC发展。
图3. 黑米饮食（BRD）改变了ApcMin/+模型中肠道微生物组成，并增加了有益细菌的丰度
(A) 使用Simpson指数进行的Alpha多样性分析，包括14周时的野生型小鼠、对照（CD）饲养的小鼠或BRD饲养的小鼠（WT_14，每组n = 38，CD_14，每组n = 15，BRD_14，每组n = 14）和22周时的野生型小鼠、CD饲养的小鼠或BRD饲养的小鼠（WT_22，每组n = 14，CD_22，每组n = 22，BRD_22，每组n = 15）。(B) 使用Bray–Curtis距离进行的Beta多样性分析。(C) 用于区分黑米和CD之间或WT和CD之间的标志微生物的鉴定（p <0.05，LDA> 2）。(D) Lactobacillus johnsonii和Bacteroides uniformis的相对丰度。(E) 共现分析：微生物之间的Spearman相关系数。不同颜色代表不同的细菌。红线表示正相关，蓝线表示负相关，灰线表示无相关性。(F) 通过荟萃分析在六个队列数据集中的Bacteroides uniformis的相对丰度。(G) 用B. uniformis和大肠杆菌（作为阴性对照）处理的CRC细胞系HCT116和SW620的细胞生长曲线。BRD，黑米饮食; CD，对照饮食; CRC，结肠癌; LDA，线性判别分析。数据表示为平均值±SD。*p <0.05，**p <0.01，***p <0.001，N.S.，无显着差异。点图反映了独立实验的数据点。
BRD改变了肠道代谢物组成，增强了色氨酸代谢途径
为了研究不同饮食引起的微生物变化对宿主和微生物代谢的影响，我们对ApcMin/+和AOM/DSS模型在癌前期和肿瘤期进行了粪便代谢组学分析。在ApcMin/+癌症模型中，主成分分析（PCA）表明样本按不同的饮食聚集，表明BRD饲养的小鼠和CD饲养的小鼠之间的代谢物组成存在差异（图4A）。为了确定与每个饮食组相关的差异代谢物，我们比较了BRD饲养的ApcMin/+小鼠和CD饲养的ApcMin/+小鼠，以及CD饲养的WT小鼠和CD饲养的ApcMin/+小鼠，在14周和22周时。在CD饲养的ApcMin/+小鼠和BRD饲养的ApcMin/+小鼠之间以及CD饲养的WT小鼠和CD饲养的ApcMin/+小鼠之间共同鉴定了203种差异代谢物（图4B和支持信息S2：表S5）。其中，吲哚和吲哚-3-乳酸酸，都是在14周和22周时BRD饲养的小鼠中最显著上调的异常代谢物之一（图4B）。接下来，我们对这些差异代谢物的来源进行了分类。结果发现，除了其他类型外，来自微生物、宿主和共享代谢物的代谢物占剩余代谢物的大多数（15.30%）（图4C）。BRD饲养的ApcMin/+小鼠和CD饲养的WT小鼠的共同上调代谢物的富集分析显示色氨酸代谢途径被增强（图4D）。在这一途径中，L-色氨酸、吲哚和吲哚-3乳酸酸被认为是宿主-微生物相互作用的代谢物，在BRD饲养的小鼠的影响下得到了富集（图4E）。此外，Spearman相关系数显示这三种代谢物与B. uniformis呈正相关（图4F），从而确认这三种代谢物都可以通过MetOrigin数据库参与色氨酸代谢途径（支持信息S2；表S6）。
为了证实这些发现的普遍性，我们以类似的方式评估了AOM/DSS模型的代谢组。结果与ApcMin/+模型的结果一致，主成分分析结果表明了BRD和CD之间的显著差异（支持信息S1：图S4A）。在炎症和癌症期间，在BRD饲养的AOM/DSS小鼠和CD饲养的AOM/DSS小鼠之间以及在CD饲养的WT小鼠和CD饲养的AOM/DSS小鼠之间共同鉴定了828种差异代谢物（支持信息S1：图S4B和支持信息S2：表S7）。其中，吲哚和吲哚-3-乳酸酸在BRD饲养的AOM/DSS小鼠中也是最显著上调的异常代谢物之一（支持信息S1：图S4B）。值得注意的是，24.95%的差异代谢物来自微生物、宿主或两者（支持信息S1：图S4C）。与先前的发现一致，这些代谢物也与色氨酸代谢途径有关（支持信息S1：图S4D）。
为了进一步阐明BRD对宿主小鼠的影响，对血清代谢进行了调查。PCA结果显示，在22周时，BRD饲养的ApcMin/+小鼠和CD饲养的ApcMin/+小鼠的血清中受BRD影响的代谢物显示出显著差异（支持信息S1：图S5A）。总共有223种代谢物在这两组之间存在显著差异（支持信息S1：图S5B和支持信息S2：表S8），其中31.82%来自微生物和宿主-微生物共享（支持信息S1：图S5C）。上述血清代谢物的浓度分析显示，色氨酸代谢在BRD饲养的小鼠中仍然富集（支持信息S1：图S5D）。这些发现表明，BRD激活了与微生物-宿主相互作用有关的色氨酸代谢途径，这可能是影响宿主肠道健康的重要因素之一。
图4. BRD改变了ApcMin/+模型中肠道粪便代谢物的组成，并增强了色氨酸代谢途径
（A）PCA 图显示野生型小鼠、控制饮食小鼠和黑米饮食小鼠在 14 周（WT_14、CD_14 和BRD_14）和 22 周（WT_22、CD_22 和 BRD_22）时肠道代谢组学分析的结果。WT_14：n=14，CD_14：n=16，BRD_14：n=15，WT_22：n=14，CD_14：n=16，BRD_22：n=15；（B）鉴定区分黑米和对照饮食或野生型小鼠和对照饮食小鼠之间的标记代谢物；（C）分析不同代谢物追溯的差异性：宿主（4.08％）、微生物（7.14％）、宿主-微生物共有（4.08％）、食品相关（14.29％）和其他来源（70.41％）的百分比；（D）不同来源代谢物的富集分析。色氨酸代谢途径以红色突出显示；（E）色氨酸、吲哚及吲哚-3-乳酸在 14 周和 22 周不同饮食间的相对浓度；（F）色氨酸、吲哚及吲哚-3-乳酸与单形拟杆菌的相关性分析。
吲哚和吲哚-3-乳酸激活宿主芳烃受体（AHR）以抑制CRC的发展
为了探索黑米饮食改变的代谢物在 CRC 发展中的潜在功能，我们用与微生物直接相关的吲哚及吲哚-3-乳酸处理了两种 CRC 细胞系。共培养实验显示，处理两天后，吲哚和吲哚-3-乳酸抑制了 HCT116 和 SW620 两种 CRC 细胞系的细胞增殖（图5A和支持信息S1：图S6A-C）。同时，细胞周期分析显示，与对照组相比，吲哚和吲哚-3-乳酸处理减缓了 HCT116 和 SW620 细胞从 G1 期到 S 期的细胞周期进程（图5B和支持信息S1：图S6D-F）。与这些观察一致，两种 CRC 细胞系中的 PCNA 和 Cyclin D1 蛋白表达下调，表明吲哚和吲哚-3-乳酸处理抑制了细胞增殖（图5C和支持信息S1：图S6G-I）。此外，我们还检查了吲哚和吲哚-3-乳酸对上皮屏障功能的影响。与对照组相比，吲哚和吲哚-3-乳酸处理的 HCT116 和 SW620 细胞中 Occludin 和 Claudin-3 蛋白的表达增加，表明吲哚和吲哚-3-乳酸能够保护屏障功能（图5D和支持信息S1：图S6J-L）。综上所述，这些结果表明，黑米饮食通过增加抗癌代谢物吲哚和吲哚-3-乳酸保护肠道健康，减缓CRC 的发展。
吲哚是一种由肠道微生物代谢色氨酸产生的代谢物，已被证明能激活宿主中的AHR。AHR是一种配体激活的转录因子，调节与解毒、细胞增殖和免疫有关的各种基因的表达。吲哚激活的AHR与抑制CRC发展相关联。
为了获得AHR的核心靶基因及其功能信息，我们从GTRD（http://gtrd.biouml.org/）下载了在转录起始位点（TSS）附近5000 bp的上游和下游富集的7497个靶基因，并且考虑了具有site-Count > 2的基因作为AHR的核心靶基因，共计2805个（支持信息S1：图S7A）。随后，我们探索了AHR下游靶基因的表达模式。使用k-means聚类方法，我们根据肠道样本（WT、CD和BRD）中的表达模式将这些基因分为四个簇。在这些簇中，有两个有趣的簇基因值得关注。簇2表现出一种在WT和BRD饲养的小鼠中基因表达较CD饲养的小鼠更高的模式。相反，簇3显示了在WT和BRD饲养的小鼠中基因表达较低的模式（图5E）。在提取了这两个簇中的基因后，进行了通路富集分析。簇2中的基因富集在与肠道功能密切相关的通路中，包括紧密连接和糖胺聚糖生物合成。另一方面，簇3中的基因主要富集在与免疫和炎症相关的通路中，如免疫细胞分化和受体信号传导、核因子-κB信号传导和磷脂酰肌醇3-激酶-Akt信号传导，表明与BRD响应中AHR靶基因的上调与肠道健康之间存在密切联系。
为了进一步验证AHR信号通路下游基因的表达是否受到吲哚和吲哚-3-乳酸酸激活，本研究进行了实时聚合酶链反应，比较了CD饲养和BRD饲养小鼠之间的基因表达水平。结果显示BRD饲养的小鼠中AHR下游靶基因（包括Cyp1a1、Cyp1b1、Znrf3、Esr1和Ptgs2）的上调（图5F）。此外，在接受了BRD饲养小鼠的小鼠结肠组织中，我们观察到AHR下游靶基因Znrf3和Cyp1b1的表达水平升高（支持信息S1：图S7B）。
为了进一步研究吲哚和吲哚-3-乳酸酸通过激活AHR信号通路抑制CRC发展，我们选择AHR信号通路抑制剂CH-223191来评估其对两种CRC细胞系增殖的影响。我们的研究结果显示，吲哚和吲哚-3-乳酸酸对细胞增殖的抑制作用在CH-223191的处理下被抵消了（图5G和支持信息S1：图S8A）。此外，在添加抑制剂的情况下，吲哚和吲哚-3-乳酸酸对细胞周期进展的抑制作用也被消除了（图5H和支持信息S1：图S8B），表明吲哚和吲哚-3-乳酸酸通过激活AHR信号通路保护肠道屏障功能（图5I和支持信息S1：图S8C）。这些发现提供了额外的证据，支持了BRD以促进AHR信号通路激活的方式调控肠道微生物组，最终有助于减缓CRC的发展。
图5. 吲哚-3-乳酸激活宿主AHR以抑制细胞增殖和细胞连接障碍
（A）用吲哚-3-乳酸处理的结肠癌（CRC）细胞系HCT116细胞的细胞生长曲线及其载体（作为阴性对照）。（B）用或不用吲哚-3-乳酸处理的HCT116细胞经偏振碘化丙啶（PI）染色并通过流式细胞术分析。（C）在用吲哚-3-乳酸和载体处理的HCT116细胞中，与细胞增殖和细胞周期相关的蛋白质，如增殖细胞核抗原（PCNA）和cyclin D1的表达水平。（D）在用或不用吲哚-3-乳酸处理的HCT116细胞中，肠道屏障功能相关蛋白occludin和claudin-3的表达水平。（E）WT，黑米饮食（BRD）和CD饮食小鼠结肠组织中AHR核心靶点的差异表达模式以及Cluster2和Cluster3中核心靶点富集的KEGG途径。（F）qRT-PCR结果表明BRD促进了AHR下游靶基因的表达。相对RNA水平相对于对照β-actin进行标准化。（G）用DMSO，吲哚-3-乳酸，DMSO + CH-223191（AHR的一种强效且特异的拮抗剂）和吲哚-3-乳酸+ CH-223191处理的CRC细胞系HCT116结肠细胞的细胞生长曲线。（H）用DMSO，吲哚-3-乳酸，DMSO + CH-223191和吲哚-3-乳酸+ CH-223191处理的HCT116细胞经PI染色并通过流式细胞术分析。（I）在用DMSO，吲哚-3-乳酸，DMSO + CH-223191和吲哚-3-乳酸+ CH-223191处理的HCT116细胞中，肠道屏障功能相关蛋白occludin和claudin-3的表达水平。相对蛋白水平相对于对照β-actin进行标准化。AHR，芳香烃受体; DMSO，二甲基亚砜; KEGG，基因和基因组的京都百科全书; qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应。数据表示为均值±SD。*p < 0.05，**p < 0.01，N.S.，无显着差异。
方 法
1. 黑米饲料（BRD）的制备。
根据AIN-93M饲料，设计了用于小鼠的纯化饮食的配方。首先，确定了当年产的大米的成分，以确定蛋白质、钙、磷等成分的含量。随后，使用AIN-93M饮食提供的参考成分平衡了配方。该饮食由深圳市睿帝科技有限公司制造。将大米首先与干冰混合，然后在4°C下研磨成粉。然后与酪蛋白等成分均匀混合，并在室温下进行挤压和造粒。造粒后，将饮食在32°C下干燥18小时，以确保含有12%的水分，然后进行真空包装、辐照灭菌并储存在−20°C。用于制作饮食的大米每年产生一次，成分由公司提供，每3个月进行一次饮食生产，以确保新鲜和质量。详细的饲料营养配方显示在支持信息S2: 表S1中。
2. CRC小鼠模型
AOM/DSS模型：4周龄的C57BL/6小鼠（湖南SJA实验动物有限公司）在进行1周的适应性饲养期后，根据它们的体重随机分为两组，一组接受黑米饮食（Readydietech Co., Ltd）（每组45只小鼠），另一组接受对照饮食（每组45只小鼠）。小鼠在8周龄时腹腔注射10 mg/kg的AOM（默克）。然后进行三个周期的DSS（MP生物医学）处理，模拟结肠炎相关的CRC 。每个周期包括7天的2.0% DSS补充饮用水，然后是14天的普通水。
ApcMin/+小鼠：国家啮齿动物种质中心（SJA实验动物有限公司）提供。
进行表型实验的AOM/DSS小鼠于第156天安乐死，ApcMin/+模型于第154天在麻醉下被杀死，以收集每组的血清和各种组织样本。根据欧洲2010/63指令，应该在测试期间将同性别的动物（每笼四只小鼠）配对饲养，以确保它们的社交需求得到满足。小组内的小鼠的空间排列是随机的。小鼠被保持在受控环境中，保持特定病原体的条件，并且有12小时的光暗循环。所有程序均符合华中农业大学动物实验伦理委员会批准的指南。
3. 寿命测量
用于存活率统计的ApcMin/+小鼠被随机分为黑米饲料组（n = 35）和对照组（n = 37）。在2周的适应性喂养期后，它们分别被喂养黑米饲料和对照组饲料。在寿命统计过程中，我们只记录了发展出CRC的ApcMin/+小鼠的寿命（每组小鼠用于确定存活率直到34周龄）。对肠道进行解剖以验证肿瘤的存在。如果小鼠满足以下任何一项标准，将被杀死：（1）无法进食或饮水，（2）肿瘤或其他疾病出血，或（3）侧卧，即对刺激没有反应或无法恢复直立姿势。
4. 无菌小鼠模型
为了研究由黑米饮食调控的肠道菌群对健康结肠黏膜的直接影响，8周龄的无菌BALB/c小鼠（Gempharmatech Co., Ltd）被分为两组（每组七只小鼠），并维持在对照饮食上。然后，小鼠用从黑米饮食和对照饮食小鼠中获得的粪便样品分别灌胃。总体而言，将1克粪便样品充分混合在5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。然后通过胃管灌胃，给予受体小鼠200μL的溶液。在第一周，进行每日一次的粪便菌群移植。在第二周，每周进行三次，随后的几周，每周进行一次。在灌胃后的8周处安乐死动物。
5. 宏基因组测序及分析
将收集的小鼠的粪便样本邮寄到华大基因（武汉，中国）进行 PE 文库的构建。测序流程及仪器均由华大基因提供。按照常规的宏基因组分析流程包括高质量 reads 进行数据质量控制、宿主基因组比对、清理宿主污染、然后进行下游的丰度构建以及物种/功能差异分析。本次研究的具体分析流程如下：
序列质控：数据下机后，在 Linux 服务器上调用 KneadData 流程（Beghini et al.
2021）进行宏基因组数据质控。采用 Trimmomatic（Bolger et al. 2014）对 reads 的adapter 序列剪切，并去除长度小于 50 bp、平均碱基质量值低于 20 bp 和含 N 碱基的 reads，获得后续分析需要的质量更好的序列。去除宿主污染：调用 KneadData 流程将宿主基因组序列比对至对应数据库中并去除宿主序列。使用 Bowtie2（Langmead and Salzberg 2012）将基因组 reads 与小鼠参考基因组（mm39）比对，去除比对上的宿主污染 reads 后，合并双端 reads 以便后续进行微生物物种分类。MetaPhlAn3软件，版本3.0.14，用于测量所有样本中微生物群落的分类组成。此外，使用HUMANn3软件版本3.0.1来检查通路和基因家族的丰度。使用LEfSe 筛选差异细菌，考虑到满足线性判别分析FC > 2且p < 0.05的标准的候选者。
6. 代谢组学分析和代谢物谱分析
超性能液相色谱-质谱原始数据使用MSConvert工具（http://proteowizard.sourceforge.net/downloads.shtml）转换为mzXML格式，以便进行后续分析。在R（v3.4.1）中使用XCMS软件包执行非线性保留时间校正、峰过滤和提取。获取的谱图，包括质荷比（m/z）、保留时间和离子强度，经过metaX软件包在R（v3.4.1）中的进一步分析。该分析包括使用质量控制样品进行信号校正和峰值归一化。
在数据中替换缺失值为最小值，然后保留具有质量控制方差小于0.2的代谢物。代谢组学数据进行对数处理以接近正态分布。然后使用t检验识别潜在的候选者，其中FDR p值小于0.05作为筛选标准之一。另一个要求是变量在标准化数据后由正交偏最小二乘判别分析（使用R包ropls版本1.20.0）确定的重要性得分大于1。Spearman相关性用于计算不同细菌和代谢物之间的关联。使用ComplexHeatmap（v2.4.3）包构建了热图R包[68]。代谢物来源分类和代谢物富集研究使用MetOrigin数据库进行。Deep MetOrigin Analysis的功能项目确认了代谢物和微生物之间的真实关联以及网络构建。
7. 公共队列宏基因组分析
六个结肠癌宏基因组数据集的公共数据从curatedMetagenomicData R包中下载，排除了其他疾病如腺瘤、2型糖尿病、脂肪肝和高血压的样本。为了确保一致性和数据质量，上述标准样本数据然后经过严格的过滤：(1)相对读数较低的样本(≤1,000,000)被排除在外，可能是由于低测序深度和宿主读数的污染。(2)移除异常值和疑似污染案例，包括高物种计数(物种读数≥总数的50%)和低物种计数(物种读数≤0.01%*1/n; N是每个研究中不同疾病状态的样本数量)。(3)丢弃低丰度的物种(物种读数≤总数的0.001)。公共数据宏基因组分析采用元分析方法，确定主要混杂因素的方法与先前的研究一致。
8. 吲哚和吲哚-3-乳酸酸处理，细胞增殖和细胞周期分析
吲哚（目录号HY-W001132，MedChemExpressA）和吲哚-3-乳酸酸（目录号HY-113099，MedChemExpress）从MedChemExpress获得。CRC细胞系HCT116和SW620被分别种植在96孔板中，每孔5000个细胞。细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，分别用PBS、或溶剂、或2μmol/L吲哚、或2μmol/L吲哚-3-乳酸酸处理，持续至多2天。对于细胞计数，每天将细胞用胰蛋白酶消化并计数。
对于细胞周期分析，细胞在去除血清的条件下培养24小时，然后在0.1%脂肪酸无血清牛血清白蛋白/溶剂或2μmol/L吲哚、或2μmol/L吲哚-3-乳酸酸的0.1%脂肪酸无血清牛血清白蛋白中培养12小时。细胞用70%乙醇固定，然后用丙碘酮染色，最后通过流式细胞术检查。
9. 转录组数据分析
使用FastQC（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）检查原始测序fastq文件的质量。使用fastp（v0.23.2）进行高质量修剪。使用HISAT2（v2.2.1）将配对末端reads映射到Ensembl的参考基因组（GRCm39）。SAMtools（v1.14用于对齐BAM文件进行排序和索引。使用Subread（v2.0.1）软件包中的featureCounts程序对reads进行计数。使用DESeq. 2（v1.28.1）筛选不同组的差异基因，而使用ClusterProfiler（v3.16.1）进行富集分析。
10. 统计分析
统计分析使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software Inc.）和R软件，版本为4.0.3进行。对分类变量的比较采用χ2检验。非参数的Kruskal–Wallis检验用于比较三组（WT、CD和BRD组）之间的微生物差异。代谢物分析使用标准化（Z值）数据。通过多元线性回归方法检验物种多样性的协变量效应。进行代谢物的Euclidean距离和细菌的Bray–Curtis距离的组间差异测试（排列多元方差分析）。p < 0.05和经过Benjamini–Hochberg校正的FDR值用于统计学显著性。Spearman秩相关系数用于估计微生物-微生物或微生物-代谢物之间的相关性。
细节请见Supporting Information S1。
讨 论
肠道菌群紊乱是CRC发病机制中的潜在因素之一。肠道菌群的失调可能增加肠粘膜通透性，加重肠黏膜上皮损伤，最终导致肠道肿瘤的恶化。肠道菌群的失调，受到生活方式和饮食习惯的影响，可能在CRC的发病机制中发挥关键作用。本研究旨在探讨BRD对结肠癌小鼠模型中肠道菌群和代谢的影响以及它们对宿主的不良影响，目标是调控肿瘤的发展进程（图6）。
黑米是一种富含各种营养和生物活性成分的色米变种。其成分包括必需氨基酸、有效脂肪、膳食纤维、各种维生素和矿物质、花青素、酚类化合物、γ-谷醇、生育酚、生育三烯酚、植物固醇和植酸。这些多样的成分有助于黑米的促进健康的特性，使其成为保持整体健康宝贵的膳食组成部分。膳食纤维在预防和治疗CRC方面发挥作用。研究发现，全谷物的摄入具有预防作用，可使发展CRC的风险略微降低。膳食纤维的主要功能包括促进肠道蠕动、有益的肠道菌群平衡、降低胆固醇、稳定血糖水平、抗氧化和抗炎作。不仅是黑米中的膳食纤维，丰富的花青素也对预防和抑制CRC的发展具有潜在作用。花青素可以抑制结肠癌细胞的增殖，保护肠道屏障功能，并抑制血清中炎症水平，从而预防和阻断CRC的发生和发展。
在本研究中，我们观察到与对照组相比，在ApcMin/+和AOM/DSS CRC小鼠模型中，食用BRD的小鼠体重减轻。此外，BRD小鼠显示出腺瘤数量和大小减少、肠道屏障结构完整性增强、肠道屏障功能改善、促炎细胞因子水平降低以及抗炎细胞因子水平升高。此外，来自粪便菌群移植实验的结果表明，接受来自BRD组的菌群的无菌小鼠在肠道屏障功能上比接受CD组小鼠的无菌小鼠更为完整。这些结果表明BRD可以在一定程度上调节肠道微生物的稳态，并潜在地缓解CRC小鼠模型中肿瘤的发展。
接下来，我们发现食用BRD的小鼠和食用CD的小鼠具有不同的菌群组成。我们发现BRD增加了两种模型中有益的肠道细菌的数量，包括B. uniformis和Lactobacillus。研究表明B. uniformis能够减轻高脂饮食引起的代谢变化，改善树突状细胞抗原呈递，并在肥胖模型中影响CD细胞的增殖，同时减轻炎症。此外，有报道称其在健康志愿者的粪便中比患有CRC的患者更丰富，并在富含纤维的环境中增加。通过分析六个公共数据集，我们还验证了该菌在人体和小鼠肠道中的共存性以及在健康志愿者中更丰富的事实。为了证明致病菌群与疾病表型之间的因果关系，我们进一步评估了BRD-和CD-介导的肠道菌群对无菌小鼠肠道的影响。结果显示BRD-介导的肠道菌群诱导了较轻度的肠癌和更完整的肠道屏障功能。值得注意的是，B. uniformis在黑米粪菌移植组中仍然更为丰富。来自黑米的花青素和花青素单体已经表现出益生作用。为了进一步探讨B. uniformis在BRD组富集的潜在原因，我们首先对黑米提取物和饮食进行了有针对性的花青素测序。结果显示花青苷-3-葡萄糖是黑米提取物和饮食中最丰富的花青素成分。适量的C3G添加到B. uniformis培养基中促进了其生长。这些发现表明C3G可能是导致B. uniformis在BRD组中富集的关键因素。此外，两种癌细胞株SW620和HCT116在B. uniformis处理下生长受到抑制。这些结果表明黑米通过促进B. uniformis的增殖抑制结肠癌的发展。
Lactobacillus gallinarum产生并分解L-色氨酸，释放出ILA，以抵抗结直肠癌。在我们的研究中，色氨酸代谢途径在健康、BRD和WT组中得到了丰富，相关的代谢产物如色氨酸、吲哚和吲哚-3-乳酸酸分别由Lactobacillus和B. uniformis产生和利用。吲哚和吲哚-3-乳酸酸是天然存在于蔬菜、水果、谷物和肉类等食物中的化合物，具有一定的抗癌作用。吲哚通过激活Nrf2信号通路来促进肠粘膜细胞的自我修复能力，减少有害物质对肠道的损伤。同时，吲哚还能抑制Wnt信号通路，从而抑制肠道肿瘤的生长。吲哚-3-乳酸酸也具有抗结直肠癌的效果，主要通过激活AHR信号通路。吲哚-3-乳酸酸能够结合AHR受体，从而激活AHR信号通路，抑制结直肠癌细胞的生长和扩散，降低结直肠癌的发生率。此外，在我们的研究中，吲哚和吲哚-3-乳酸酸抑制了癌细胞的生长。这些发现表明，B. uniformis和乳酸菌可能通过它们的代谢产物在BRD中发挥协同的有益作用。
此外，我们调查了吲哚和吲哚-3-乳酸酸影响宿主的机制。AHR途径与结直肠癌发展的关系已经得到广泛研究。AHR的激活在癌症发展的背景和阶段上表现出促瘤和抗瘤的双重效应。AHR的激活可通过诱导与细胞增殖和存活、血管生成以及炎症有关的基因的表达，促进肿瘤生长。另一方面，AHR的激活也可以通过促进免疫细胞的分化和激活，从而靶向和消除癌细胞，发挥抗肿瘤效应。在本研究中，我们发现AHR及其下游靶基因在BRD饲喂的小鼠的肠道基因转录水平上调。吲哚的抑制作用在添加AHR途径抑制剂后消失，表明富含黑米的吲哚和吲哚-3-乳酸酸作为AHR配体激活AHR途径，从而减轻结直肠癌的发展。
总的来说，我们的研究揭示了相对于CD饲喂的小鼠，BRD抑制了ApcMin/+和AOM/DSS小鼠的结直肠发育，并延长了结直肠癌模型小鼠的寿命。我们的研究结果表明，BRD可能通过促进保护性的肠道菌群和代谢物谱来保护肠道发育，这可以对抗肠道微生物失调并保护结直肠癌模型小鼠的肠道屏障功能。这些结果还暗示了全谷物，尤其是黑米主食，在人类健康方面具有巨大的潜在价值。
代码和数据可用性
本研究生成的数据集存储在中国科学院北京基因组研究所/中国国家生物信息中心的国家基因组科学数据中心（GSA: CRA008369 和 OMIX: OMIX001920），可以通过 https://bigd.big.ac.cn/ 进行公开访问。代码和所有分析结果可在 https://github.com/Yichel518/Dietary-analysis-for-CRC 找到。补充材料（方法、图表、表格、脚本、图形摘要、幻灯片、视频、中文翻译版本和更新材料）可在在线 DOI 或 iMeta Science http://www.imeta.science/ 中找到。
引文格式：
Wang Ling, Yi‐Xuan Tu, Lu Chen, Ke‐Chun Yu, Hong‐Kai Wang, Shu‐Qiao Yang, Yuan Zhang, et al. 2023. “BlackRice Diet Alleviates Colorectal Cancer Development through Modulating Tryptophan Metabolism and Activating AHR Pathway.” iMeta e165. https://doi.org/10.1002/imt2.165
作者简介
王玲（第一作者）
● 华中农业大学博士毕业生，2021年9月至2023年7月在华中农业大学和中国农业科学院农业基因组研究所从事博士后研究。
● 现为University of California, San Francisco (UCSF)博士后。主要专注于肠道微生物与结直肠癌，肠道微生物与卵巢衰老等领域研究，相关研究成果发表在iMeta，Advanced science，Clinical and Translational Medicine以及Journal of Cellular Physiology等期刊。
涂懿璇（第一作者）
● 华中农业大学博士毕业生，现为华中农业大学生物医学与健康学院博士后。
● 擅长联合多组学探究不同饮食影响的肠道微生物和宿主代谢变化与器官衰老的关系。目前以共同第一作者在国际学术期刊Advanced science、Water Biology and Security，iMeta发表论文4篇。
陈露（第一作者）
● 华中农业大学博士毕业生，现为农业农村部食物与营养发展研究所助理研究员。
● 主要研究方向是探究食源性微量元素在调控肠道菌群、减轻结肠炎，以及对非酒精性脂肪肝的作用机制。相关研究结果发表在iMeta及Food Chemistry等国际学术期刊。
陈振夏（通讯作者）
● 华中农业大学生命科学技术学院、生物医学与健康学院教授、博士生导师，riefings in Bioinformatics 副主编（Deputy Editor）。
● 2011年在北京大学获得生物信息学博士学位；2011-2016在美国国立卫生研究院从事博士后研究。现主要开展营养基因组学研究，采用“果蝇-小鼠-人”比较基因组学研究策略，通过动物和人类营养健康的多组学数据整合分析，评估“基因-膳食-表型”的关联及其分子机制。迄今以通讯或第一作者发表Advanced Science, Genome Biology, Genome Research, Nucleic Acids Research, Molecular Biology and Evolution, Briefings in Bioinformatics等SCI论文18篇。
梁新军（通讯作者）
● 湖北省肿瘤医院主任医师，教授。
● 湖北省抗癌协会理事兼学术部长，任湖北省抗癌协会肿瘤分子标志及转化医学专业委员会（第一届）委员，武汉市医学会第十八届肿瘤专业委员会委员，入选武汉市中青年医学骨干人才。擅长肺癌、消化道肿瘤、乳腺癌、淋巴瘤等恶性肿瘤的诊断和规范化治疗，并对肿瘤的靶向治疗和生物免疫治疗有深入的研究，已发表学术论文30余篇，其中以第一作者及通讯作者发表SCI论文8篇。
魏少忠（通讯作者）
● 湖北省肿瘤医院院长、教授、主任医师、医学博士、博士生导师。
● 湖北省肿瘤医院大肠癌首席专家和前列腺癌首席专家， FACS国家卫生计生委突出贡献中青年专家，湖北省首届医学领军人才，湖北省政府津贴专家，湖北省癌症中心主任、湖北省肿瘤防办主任、湖北省肿瘤医学质量控制中心主任、湖北省、武汉市结直肠癌临床医学研究中心主任。
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1卷1期
1卷2期
1卷3期
1卷4期
2卷1期
2卷2期
2卷3期
2卷4期
期刊简介
“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百位华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表原创研究、方法和综述以促进宏基因组学、微生物组和生物信息学发展。目标是发表前10%(IF > 15)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！目前期刊已经被ESCI、Scopus等数据库收录。
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