《生物化学与分子生物学》----蛋白质----听课笔记（七）

第六章  蛋白质结构与功能的关系

4.4.1 蛋白质结构与功能的关系（1）

• 同源蛋白质的物种差异与生物进化
• 不同物种中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质（homologous proteins），如脊椎动物中的血红蛋白。
• 同源蛋白质中氨基酸序列具有明显的相似性，这种相似性叫序列同源性（sequence homology）
• 同源蛋白质的氨基酸序列有许多位置的氨基酸残基对许多物种是相同的，称不变残基（invariant residue）；而有些是不同的，称可变残基（variable residue）。
• 28个不变的氨基酸残基，是生物功能所不可缺少的，其中有的有可能是参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与识别并结合细胞色素还原酶和氧化酶。
• 蛋白质的一级结构对蛋白质的生物学功能具有非常大的影响。

4.4.2 蛋白质结构与功能的关系（2）

• 肌红蛋白（Myoglobin）和血红蛋白（Hemoglobin）的结构与功能
• 血红素（heme）
• Hb的氧合曲线
• Mb和Hb的氧合曲线比较
• Hb的变构效应和氧气的运输
• 血红蛋白存在两种构象：T态（紧张态）；R态（松弛态） tense relex
• T态指的是对氧亲和力低的状态。
• R态指的是对氧亲和力高的状态。
• 当一个与血红蛋白中的一个氧分子亚基结合会增加其他未结合氧分子的亚基对氧分子的亲和力。这种效应称为正协同促效应。
• 氧合过程中血红素铁原子的变化
• 氧合过程中铁原子位移引发的构象改变

4.4.3 蛋白质结构与功能的关系（3）

• 和促进的释放（Bohr效应）。
• Bohr效应其实是指pH对血红蛋白氧亲和力的影响。
• 波尔效应涉及Hb的6个氨基酸残基。
• 氧的S形曲线结合，波尔效应以及BPG效应物的调节使得血红蛋白的输氧能力达到最高效应。同时由于能在较窄的氧分压范围内完成输氧功能，因此使肌体的氧水平不一致有很大的起伏。此外血红蛋白使肌体内的pH也维持在一个较稳定的水平。
• 血红蛋白的别构效应充分地反映了它的生物学适应性、结构与功能的高度统一性。

第七章  蛋白质的分离、纯化和表征

4.5.1 蛋白质的分离、纯化和表征（1）

• 蛋白质的酸碱性质
• 蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，则解离情况相反。
• 等电点（pl）：在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一pH值称为该蛋白质的等电点（pl）。
• 等电pH并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。
• 等离子点（isoionic point）：蛋白质在纯水溶液中的带电状态则没有其他例子干扰，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。
• 蛋白质的分子大小和分子量的测定

1. 根据化学组成测定最低相对分子量：用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可计算出蛋白质的最低分子量。也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。
2. 渗透压法测定相对分子量，渗透压公式。缺点：不能确定溶液蛋白质分子是否均一。
3. 沉降分析法测定Mr。沉降速度法：在强大的离心场中，如果蛋白质溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白质会发生沉降。沉降速度决定于蛋白质的分子量、分子密度、分子形状和溶剂的密度、粘度。沉降系数。沉降平衡阀。
4. 凝胶过滤法测定Mr（目前常用）。凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。测定蛋白质Mr一般采用交联葡聚糖，其商品名为Sephadex。
5. SDS-PAGE法测定Mr（目前常用）。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。

4.5.2 蛋白质的分离、纯化和表征（2）

• 胶体性质与蛋白质的沉淀
• 蛋白质胶体溶液的稳定性：蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围（1~100nm）。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水称为稳定的亲水胶体溶液。
• 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：双电层，水化层（丁达尔效应，布朗运动，不能透过半透膜）
• 蛋白质的沉淀：蛋白质胶体溶液的稳定性是具有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。
• 蛋白质沉淀方法：盐析法；有机溶剂沉淀法；重金属盐沉淀方法；生物碱试剂和某些酸类沉淀法；加热变性沉淀（煮鸡蛋，制豆腐 哈哈）。
• 蛋白质的变性和复性：在某些物理或化学因素作用下，天然蛋白质严密的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失，则称之为蛋白质变性作用。
• 蛋白质的沉淀和蛋白质的变性是两个概念，不一样的。变性的蛋白质会沉淀，但是沉淀的蛋白质不一定是变性的。
• 有些蛋白质的变性是可逆的，通过适当的方法（如透析）将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立体结构，这个过程称为复性。
• 一般认为蛋白质的变性本质是次级键的破坏，只有空间构象的改变，并不涉及以及结构（共价键）的变化。
• 变性化学因素：强酸，强碱，有机溶剂，重金属盐，生物碱试剂，尿素等。
• 变性物理因素：加热、射线、超声波、剧烈震荡等。
• 变性后蛋白质的表现：旋光值改变，特性粘度增加，溶解度降低，扩散系数降低，结晶能力丧失，易于沉淀，若加热还会凝固。但若原理等电点则不一定沉淀。变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化。

4.5.3 蛋白质的分离、纯化和表征（3）

• 蛋白质分离纯化的一般原则：

1. 根据分子量：如沉降速度法离心
2. 根据密度：沉降平衡法离心
3. 根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳
4. 根据分子量和分子形状：凝胶过滤
5. 根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀
6. 根据电荷：等电点沉淀

• 根据分子大小不同的分离纯化方法：透析，超过滤，凝胶过滤法
• 透析：利用半透明膜的选择通透性来纯化像蛋白质这样的大分子物质的过程叫透析。
• 利用溶解度差别的纯化方法：等电点沉淀技术，盐析法，有机溶剂分离法
• 根据电荷不同的纯化方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳，离子交换层析
• 三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应。

4.5.4 蛋白质的分离、纯化和表征（4）

• 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质（蛋白质）可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固载体装柱。当待提纯的生物大分子（蛋白质）通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。
• 可逆性特异结合：抗原和抗体；激素和受体蛋白；凝集素和糖蛋白
• 蛋白质的含量测定与纯度
• 测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。
• 溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法。稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法。近年来大多数人用考马斯亮蓝法。
• 蛋白质纯度鉴定：电泳、沉淀、HPLC、N末端测序等。